手把手教你免疫组化IHC实验：揭秘细胞内的秘密

生物科研实验室

一、实验原理
IHC通过特异性抗体与目标蛋白结合，再借助二抗偶联的酶（如HRP）催化底物显色，将蛋白定位转化为肉眼可见的色斑。显色剂DAB（3,3'-二氨基联苯胺）在HRP作用下生成棕色沉淀，苏木素复染细胞核，最终形成“棕-蓝”双色对比图像。
二、实验准备
1.样本类型：石蜡切片（4μm厚）、冰冻切片（6-8μm）或细胞爬片（80%密度）。
2.关键试剂：
•固定液：4%多聚甲醛（PFA）用于石蜡切片，丙酮用于冰冻切片（-20℃预冷）。
•抗原修复液：pH 6.0柠檬酸钠缓冲液（热修复）或pH 9.0 EDTA缓冲液（酶修复）。
•封闭液：5% BSA或10%正常山羊血清（与二抗同源），含0.1% Tween-20。
•一抗/二抗：按说明书稀释（常用1:100-1:500），现用现配。
3.显色系统：HRP-DAB试剂盒（含DAB、H₂O₂）、苏木素染液。
三、操作流程
1. 样本处理与脱蜡
•石蜡切片：依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟→无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各5分钟→梯度乙醇（95%→80%）复水→蒸馏水漂洗。
•冰冻切片：室温平衡10分钟→丙酮固定10分钟→PBS漂洗3次。
•细胞爬片：4% PFA固定15分钟→PBS漂洗→0.1% Triton X-100透化10分钟。
关键细节：脱蜡不彻底会导至染色斑驳，可用苏丹黑预染验证；透化时间过长会破坏膜结构。
2. 抗原修复
•热修复：将切片浸入柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0），微波中火加热至沸腾后转低火维持15分钟，自然冷却至室温。
•酶修复：0.05%胰蛋白酶（pH 7.8）37℃消化10分钟，适用于脆性组织（如脑）。
tips：修复液体积需完全覆盖切片，避免干片；冷却时勿晃动防止组织脱落。
3. 内源性物质封闭
•过氧化物酶：3% H₂O₂甲醇溶液浸泡10分钟（避光），灭活内源酶活性。
•生物素：用Avidin/Biotin阻断试剂盒预处理（先加Avidin 15分钟，再Biotin 15分钟）。
4. 封闭非特异性结合
滴加封闭液（5% BSA + 0.1% Tween-20）覆盖组织，室温孵育1小时。脂肪组织（如乳腺）需延长至2小时，封闭后用滤纸吸干多余液体。
5. 一抗孵育
按说明书稀释一抗（如1:200），滴加至切片，4℃孵育过夜（或37℃ 1小时）。孵育盒内放置湿纱布保持湿度，避免液体蒸发导至浓度不均。
关键技巧：石蜡切片孵育时加盖Parafilm，确保抗体均匀覆盖；细胞爬片可倒置孵育减少用量。
6. 二抗与显色
•二抗孵育：HRP标记二抗（1:1000）室温孵育1小时，PBS-T（含0.05% Tween-20）漂洗3次×5分钟。
•DAB显色：按试剂盒比例混合DAB底物，滴加后显微镜下实时监控，显色至目标区域呈深棕色（约1-3分钟），立即流水终止。
注意事项：DAB现用现配，显色液变浑浊需丢弃；显色过度会导至背景发黑。
7. 复染与封片
•苏木素复染：浸染1分钟→流水返蓝10分钟→梯度乙醇脱水→二甲苯透明。
•封片观察：滴加中性树胶，加盖玻片轻压排除气泡。普通光镜下目标蛋白呈棕色颗粒，细胞核蓝色。