TUNEL染色从原理到操作，手把手教你掌握细胞凋亡检测技术

生物科研实验室

细胞凋亡是生命科学研究的核心课题之一，而TUNEL染色作为检测凋亡的“金标准”，凭借其高灵敏度和特异性，被广泛应用于病理学、肿瘤学、药理学等领域。然而，实验中的背景干扰、假阳性等问题常让科研人头疼不已。本文将从原理到操作细节，结合常见问题解析，为你全面梳理TUNEL染色的核心要点。 一、TUNEL染色原理  
1. 凋亡细胞的DNA断裂特征 细胞凋亡时，内源性核酸内切酶会被激活，将染色体DNA切割成两类片段： •大片段：50-300 kb（由内切酶初步切割产生）；   •小片段：180-200 bp的核小体单元（由Ca²⁺/Mg²⁺依赖的核酸酶进一步切割形成）。 这些断裂的DNA会暴露出大量3'-羟基（3'-OH）末端，这是TUNEL染色的关键靶点。   2. TUNEL技术的核心机制 TUNEL（TdT介导的dUTP缺口末端标记法）通过以下步骤实现凋亡细胞的特异性标记： •标记反应：在末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的催化下，带有标记物（如生物素  、荧光素或地高辛）的dUTP与DNA的3'-OH末端共价结合。   •信号放大与显色：若使用生物素标记，可通过链霉亲和素-HRP复合物与DAB底物反应，生成棕色沉淀；若为荧光素标记  ，则直接通过荧光显微镜观察。   关键点：正常细胞因DNA完整，几乎无3'-OH，故不会被标记，从而实现凋亡细胞的精准识别。 二、TUNEL染色实验步骤
实验步骤因样本类型（石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片）略有差异，以下以石蜡切片为例，梳理标准化流程： 1. 样本前处理 •脱蜡与水化：   1.切片置于60℃烘箱20分钟，加速脱蜡； 2.二甲苯浸泡2次（每次5-10分钟）； 3.梯度乙醇（100%→95%→90%→80%→70%）逐级水化，每级3分钟。 •抗原修复与通透：   1.蛋白酶K消化：20 μg/mL蛋白酶K溶液（pH 7.4-8.0）孵育15-30分钟（时间依组织厚度调整）；   2.PBS冲洗5分钟×3次，彻底清除残留酶。   2. TUNEL反应体系构建 •反应液配制：按试剂盒比例混合TdT  酶与标记液（如罗氏试剂盒中，酶浓缩液与标记液按1:9混合）。   •标记孵育：滴加反应液覆盖组织，湿盒内37℃避光孵育1小时（可延长至2小时以增强弱信号）。   3. 信号显色与复染 •DAB显色：控制反应时间在10分钟内，显微镜下监控至背景轻微着色即可终止（避免过久导至非特异性沉淀）。   •苏木素复染：浅染细胞核（约1分钟），盐酸乙醇分化后流水返蓝。   4. 封片与观察 •梯度乙醇脱水  ，二甲苯透明，中性树胶封片； •光学显微镜下观察：凋亡细胞核呈棕褐色，正常细胞核为蓝色。   三、常见问题与解决方案
1. 非特异性染色 •原因：内源性酶活性高（如肝、肾组织）、固定不当（如酸性固定液）、反应液渗漏。   •对策：   •使用中性缓冲福尔马林充分固定； •增加过氧化氢封闭时间（尤其血细胞丰富组织）。   2. 背景过高 •原因：支原体污染、红细胞自发荧光、TdT酶过量。   •对策：   •稀释TdT酶浓度（2-5倍）； •更换无血清培养基或采用其他凋亡检测方法。   3. 标记效率低 •原因：乙醇固定导至交联过度、荧光淬灭、通透不充分。   •对策：   •缩短固定时间（推荐4%多聚甲醛固定30分钟）； •全程避光操作，使用抗淬灭封片剂。 四、实验优化与注意事项
1.脱蜡务必彻底：残留石蜡会阻碍试剂渗透，建议二甲苯两次浸泡各10分钟。   2.通透时间个性化：薄切片（4 μm）用10分钟蛋白酶K，厚切片（20 μm）可延长至30分钟。   3.严格清洗步骤：TUNEL反应后需用PBS清洗5次，减少非特异性吸附。   4.双阴性对照设置：   •阴性对照1：不加TdT酶；   •阴性对照2：用DNase I预处理诱导DNA断裂，验证试剂有效性。   五、结语
TUNEL染色是揭示细胞凋亡时空分布的有力工具，但其成功依赖于对原理的深刻理解与细节把控。无论是石蜡切片的复杂前处理，还是荧光标记的避光要求，每一步都需严谨操作。希望本文能助你避开“坑点”，让凋亡细胞无处遁形！