免疫组化最常用的 3 种结果分析方法（附操作步骤）

会里很

免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）是利用抗原抗体反应以显示某蛋白的表达及定位的实验。这种实验的独特之处在于它既直观地显示了蛋白在组织及细胞或细胞亚结构的定位，又保留了组织样品的结构特征。IHC 已广泛应用于生物医学研究及临床诊断中。
目前免疫组化尚无统一的标准计量方法，但已有几种公认的 IHC 计量方法，你真的知道该如何选择吗？下面我来一一详细介绍，小伙伴们赶紧收藏转发啦～

一、积分制

积分制是对切片以细胞染色强度、阳性细胞范围进行评分，再相乘得出最终得分的方式，这是最常用的方法。

标准评分为：根据细胞染色强度评分为 4 级

• 无阳性着色（阴性）计 0 分
  
• 淡黄色（弱阳性）计 1 分
  
• 棕黄色（阳性）计 2 分
  
• 棕褐色（强阳性）计 3 分
  

根据阳性细胞百分比评为 4 级

• ≤25% 计 1 分
  
• 26%-50% 计 2 分
  
• 51%-75% 计 3 分
  
• ＞75% 计 4 分
  将两项评分相乘得出最终评分结果 [1-2]。此种方法是最贴近临床方面的，小伙伴们如果想做某因子的临床病理特征分析，那最好采用这种方法。
  二、阳性细胞数
  计数阳性细胞数适用于评估某物质是否在组织中存在以及数量，是对该物质数量而不是表达强弱的判别。如评估某细胞在该组织中的数量，可利用该细胞的特异性标志物做免疫染色。如 CD163 标记 M2 型肿瘤相关巨噬细胞，CD34 标记血管内皮细胞，CD3 标记 T 细胞等等。对于这类免疫组化，我们直接计数 20 倍镜下随机 5 个视野下的阳性细胞数，再求一个平均数即为这张片子的阳性细胞数。
  

也有计算单位面积下阳性细胞数的方法。通过统计 20 倍镜下的细胞数，在除以镜下面积，得出细胞密度，单位为 cells/mm2。
三、Image Pro Plus 软件测量平均光密度值

有时，我们想定量的分析某因子的高低表达差异，用半定量的积分制并不能很好的区分差异，我们可使用软件进行统计分析。Image Pro Plus 软件的计量原理是根据目的蛋白的着色深浅及分布面积来确定目的蛋白的表达量。通过测量出每张图片的累积光密度值（integrated option density, IOD）值以及区域面积 area 值，再计算出平均光密度值（mean density）即 mean density=IOD/area，此值反映了目标蛋白的单位面积浓度。最后取每个样本的 5 个随机区域 mean density 的平均值即为此样本的值。下面我们以分析免疫组化图片为例讲解 IPP 软件的操作步骤（假设粉红色未阳性表达区域）。
第一步：处理图像

我们分析的是免疫组化的图片，所以先要把图像 intensity 格式。在默认的 intensity 格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大。而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大。如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全相反的。
方法：measure - calibration - intensity，然后在窗口中点 new 按钮，再点一下下面的 std optical density 选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。
然后点 system - close（IPP 功能多，建议每次都检查，如果中途不再进行别的功能，打开软件后只要操作一次就行，不用每张图片都操作）



第二步：颜色选取

明确一个概念 AOI（area of  interest），即感兴趣的区域，也是我们观察的重点，也就是我们说的免疫组化阳性表达区域。这里我只介绍入门级的 2 种选择方法：吸管工具和 HIS 颜色选择系统。
先介绍吸管工具：
点击 measure---count/size，跳出如下界面。


点击 Select Colors，显示如下。



点击吸管工具，在图片上选取 AOI（可以反复点击，直到你觉得所有阳性表达都被选中，当然吸管工具右侧，有撤销，橡皮擦等修改工具）。



经过多次点击，假设现在所有阳性表达都已经被选中，那么 AOI 选取结束。
下面介绍 HIS 系统选取颜色：


在 HSI 颜色格式中，H 为色调，就是我们眼睛所看到的红橙黄绿青蓝紫等。S 为色饱和度，I 为强度。在选择 AOI 时，首先保持 S、I 为最大范围，从 H 中选择粉色部分。使用这个颜色格式的好处是，选择的颜色能包括这种颜色的不同深浅及亮度。


颜色选择好了后，就可以分析了。
*强烈推荐一个功能：点击左下角 File – save file 将此颜色信息保存，下一张图片可以调用此文件，从而减少操作误差，也简化了步骤。
第三步：分析
选择分析参数：免疫组化常见的几个参数（意义不多解释，可自行搜索）

• area 面积
  
• density（mean）平均光密度
  
• diameter 直径
  
• IOD（integrated optical density）累积光密度
  颜色选好后回到先前界面，点击 Measure-select Measurements 进入选择测量参数，最常用的四个参数已如上述。
  

这里再介绍一点，可设置范围（上图中间靠下）：每一个阳性表达区域都是有大小的，如图可以将小于 10 的阳性表达区域舍弃不计算，这个可以根据自己实际情况调整，但一般取默认值。点击 OK，回到原先界面点击 Count，得出结果得出结果（View - Statistics）：



第四步：整理数据

File - Export Data  整理
相信，这样简单介绍后能用 IPP 处理一些简单的免疫组化的图片数据。

好了，以上为 3 种免疫组织化学常用的计量方法，希望对大家免疫组化实验数据处理有所帮助，少走弯路。

具体选择哪种方法还是要根据你的研究内容和目的，最后祝大家早日发 SCI 呀～（作者：十号楼前的大树）


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