流式细胞术原理、实验步骤及应用概览

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最简单的流式细胞仪可用于检测细胞特征，包括细胞大小、细胞数量、细胞周期和细胞表型分析等。该技术可为研究人员提供单个细胞的高度特异性信息。从表达绿色荧光蛋白的细胞系到来源于组织的异质细胞群体，都是典型的流式样品类型。实现高效流式细胞分析的关键要求是将样品制备成单细胞悬液，从而确保每个细胞都能进行数据分析。
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流式细胞术简介

流式细胞术是一种常用的细胞分析技术，它在20世纪50年代首次被用于检测细胞的体积，可在细胞随快速流动的液流直线通过流动室时进行检测。从那时起，许多工程师和研究人员不断创新，最终带来了现代流式细胞仪，利用流式细胞仪，溶液中的细胞以每秒10,000个细胞（或更多）的速度通过仪器的激光检测区，进而对细胞进行检测和分析。如今的流式细胞仪可检测更多的荧光参数（从1或2至最多60个左右），利用不同颜色的荧光染料可同时检测同一个细胞上的所有这些参数。流式细胞仪运行速度快且具有单细胞水平检测能力，能够快速分析和鉴定数百万个细胞，并为细胞生物学家提供大量统计学数据，，但无法获得显微镜可提供的形态特征和亚细胞定位信息。科学，就像生活一样，一切均在于权衡取舍！请参见表1流式细胞术和显微镜技术的对比。
表 1.流式细胞术和荧光显微成像作为细胞分析技术的对比。





流式细胞术的潜在应用

流式细胞术的潜在应用非常多，包括检测和测量：

• 蛋白质表达 - 遍及所有细胞，包括细胞核内
  
• 蛋白质转译后修饰 - 包括剪切和磷酸化蛋白质
  
• RNA - 包括IncRNA、 miRNA和mRNA转录物
  
• 细胞健康状态 - 从存活率到晚期凋亡或程序化细胞死亡
  
• 细胞周期状态 - 是评估细胞处于G0/G1期、S期、G2期或多倍体状态的强大工具，包括分析细胞凋亡和活化
  
• 鉴定和表征异质样本中的不同细胞亚群 - 包括区分中枢效应记忆细胞和耗竭T细胞或调节性T细胞
  

分选用流式细胞仪还可以分选细胞并回收细胞亚群以用于后续实验。这种专业流式细胞仪又被称为荧光激活细胞分选仪（FACS），这一术语有时会与“流式细胞仪”混淆。然而，这种用法是错误的。流式细胞仪是不能进行细胞分选的分析仪器。细胞分选仪利用与流式细胞仪相似的流体学和荧光成分，但是能够将异质样品中的特定细胞群体转移到独立试管中，这通常是基于特定的荧光标记特性。如果是在无菌条件下进行收集，则这些细胞可用于进一步的培养、操作和研究。
流式细胞术工作原理概述

流式细胞仪的三个主要元件是流体学、光学和电子学系统（图1）。

• 流式细胞仪的流体系统负责将样品从样品管转移到流动池。一旦通过流动池（并通过激光束），样品将被分选出来（在细胞分选仪中）或移到废液中。
  
• 光学系统的元件包括激发光源、透镜和滤光片（用于收集和移动仪器周围的光）以及用于产生光电流的检测系统。
  
• 电子系统是流式细胞仪的大脑。在这里，来自检测器的光电流经过数字化、处理和保存，以用于后续分析。
  

图 1.流式细胞仪三大主要元件示意图。
样品上样到仪器

典型的实验从单细胞悬浮液中的荧光标记细胞开始，但是可以使用任何颗粒类型的样品。将样品置于流式细胞仪上，样品被吸到仪器中，细胞悬浮在一种被称为鞘液的生理缓冲液。流体系统（管道、泵和阀）将初始样品悬浮液排列成单列细胞流（图2），并使细胞通过流式细胞仪以进行分析。


图 2.流式细胞仪的流体学。流动池（也称为流式小室）使样品中的细胞（颗粒）排成一列。这是单细胞分析的关键步骤。
激光检测点

细胞与激光发生相互作用的地方称为激光检测点（图3）。您也可能听过它的另一个名字“激光拦截”。这是荧光检测发生的地方。当激光束照射到单个细胞时，一些光会撞到细胞内的物理结构，导致光线散射。这种光散射可被测量，并且与相对细胞大小和细胞内的结构相关。这些测量称为前向角散射（FSC）和侧角散射（SSC），取决于收集光的位置相对于激光路径的角度。几乎同时，来自激光器的光激发与细胞相关的所有荧光团，产生荧光发射。所有这些光被检测器收集并通过流式细胞仪的电子元件进行处理。通过激光检测点之后，流体系统会将不需要的细胞输送到废液桶中。在细胞分选仪中，细胞将在激光检测点被分选和输送到收集管中，以供后续实验使用。


图 3.激光检测点。在流式细胞仪内，当颗粒一个一个流过激光器前方时，激光束照射到独立颗粒的地方称为激光检测点。
总结

流式细胞术是一种强大的工具，适用于从表型分析到细胞健康状态和存活率的各种细胞分析应用。
流式细胞术的两大优点是能够测定同一样品上的大量参数（2-30个或更多），以及能够在几秒内收集数百万个细胞的信息。
流式细胞仪有3个主要组成部分，即流体学、光学和电子学系统，它们共同构成了完整的细胞分析系统（图4）。


图 4.流式细胞仪的工作元件。
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