免疫荧光必看！Protocol + 避坑 Tips：这样做能有效避免串色！

生物科研实验室

一、免疫荧光Protocol
      
   1、样品准备   ①贴壁细胞   爬片处理：建议直接使用商品化的无菌爬片，使用干净无菌的镊子将爬片放置于培养皿中。注意：爬片直径要比孔板小一圈，否则后续很难抠出来。  细胞培养：将贴壁细胞直接接种于爬片上即可，最后小心取出爬片，倒扣于盖玻片上，操作过程中需格外小心，避免细胞从爬片上脱落，可以用镊子捏住爬片边缘。     ②悬浮细胞   爬片预处理：对爬片进行多聚赖氨酸处理，或者用细胞黏附剂，使悬浮细胞贴壁。该步骤需提前几小时完成。  后续操作：处理后的爬片用于接种悬浮细胞，后续步骤与贴壁细胞一致。     2、固定   常用固定剂：甲醛是目前最常用的固定剂，一般使用2%～4%的甲醛进行室温固定20分钟即可。例如，对于细胞样品，可使用4%的多聚甲醛固定爬片15分钟，随后用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟。  特殊情况：若实验涉及磷酸化抗体，甲醛固定可能导至磷酸蛋白从细胞膜表面转移到胞浆中，因此应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇进行固定。
3、通透   通透目的：该步骤旨在使抗体能够进入细胞内部。  通透方法：使用0.5% Triton X-100（用PBS配制），在室温下通透20分钟。如果目标抗原位于细胞膜上，则无需通透。     4、封闭   洗涤：通透完成后，用PBS浸洗玻片3次，每次3分钟，吸水纸吸干PBS。  封闭液选择：常用的封闭液包括与二抗同一来源的血清、BSA（牛血清白蛋白）或羊血清，可采用5%BSA，稀释BSA可采用tbst。  封闭操作：在室温下封闭60分钟。从封闭开始，所有后续步骤需特别注意保持样品的湿润，避免样品干燥，否则极易产生较高的背景信号。     5、一抗孵育   一抗稀释：根据一抗说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗。  孵育操作：用吸水纸吸尽封闭液后，每张玻片滴加稀释好的一抗，放入湿盒中，4℃孵育过夜。  洗涤：回收一抗后，加入PBST（PBS + 0.05% Tween-20），在摇床上缓慢摇动洗涤5分钟，共洗涤3次。
6、荧光二抗孵育   二抗滴加：用吸水纸吸尽洗涤液后，滴加稀释好的荧光二抗。  孵育与洗涤：在湿盒中孵育1小时后，回收二抗，接着用PBST洗3次，每次5分钟。  避光操作：由于荧光容易淬灭，从加入荧光二抗开始，所有后续操作步骤均需避光进行。     7、复染核   复染操作：在玻片上滴加DAPI（4',6-二氨基-2-苯基吲哚），注意避光孵育5分钟。  洗涤：用PBST洗3次，每次5分钟，以洗去多余的DAPI。     8、封片及荧光观察   封片：用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。  观察：在荧光显微镜下进行观察，记录实验结果。
二、如何有效避免串色      
   在免疫荧光实验中，串色是影响实验结果准确性的重要因素之一。以下是一些有效避免串色的建议：
   •  🌟1、铺细胞别太密，且尽可能用大体积细胞
➡️太密就导至一抗结合蛋白增多，更容易出现非特异性染色，且细胞太密拍摄效果很一般，一般6孔板满孔的细胞我会取1/8的量铺到带有爬片的12孔板里，大概12小时后，细胞密度就刚刚好。
➡️用大体积细胞（例如HeLa），拍摄效果好，HEK细胞相对来说效果欠佳，若用非工具细胞，就无需考虑这个问题。  •  🌟2、核放在最后染
双抗体染色时可不用活细胞染核液（Hoechst），也就是不要最开始染核，放到最后封片时，用DAPI染，DAPI浓度不要过高，核很容易被染色，低浓度染色即可。  •  🌟3、支原体清除后再做IF
用状态好，未被污染的细胞去做IF，状态好的细胞伸展很开，染色效果也更好，若细胞支原体污染，可能会产生图4图5的现象，非特异性染色严重且去不掉，染核染抗体都会被染上乱七八糟的东西。
4、一抗浓度的问题
➡️双抗体染色若外转质粒，可染标签抗体，标签抗体更特异且使用浓度低，一般都在1：500左右；
➡️若染内源性蛋白，浓度可1：200，做之前记得看下抗体说明书该抗体是否可以做IF；
➡️4度过夜染效果更好，一抗可回收，负20保存，大概可用3次，根据抗体灵敏度决定使用次数；
➡️双抗体IF，一定要用不同抗性的，一个用鼠，一个用兔，最好不要双鼠or双兔。  •  🌟5、二抗
常温孵育1～2h，避光，避开同属性的二抗，洗一抗可用pbs，二抗可以用tbst，多加一些吐温。  •  🌟6、拍摄
封片后拍摄时，可以适当缩短激发光波长，使其没有交叉波长。
比较好的选择：绿光488，红光555。