你真的了解测序仪的测序时间（Run Time）吗？

莺歌燕舞

以下内容节选自基因Share《高通量测序仪一本通》2020完整版
在仪器的测序时间（Run time）方面，如图26所示，illumina的测序时间一般包括簇生成（Cluster Generation）、SBS化学反应与信号采集（SBS Chemistry and Imaging）、二链生成（Paired End Turnaround ）、机器清洗（Washing）四个部分。其中“SBS化学反应与信号采集”时间为测序总时间的主要构成部分（～90%）。



illumina 各测序机型测序时间组成统计表

以NovaSeq S4 PE150测序为例，测序时间为130min+6.75min/Cycle ×（Read1 151+Read2 151+index1 8+index2 8）+48min+80min=2400min，即约40hr。其中318个Cycle的“SBS化学反应与信号采集”时间为2150min，占测序时间的～90%。
关于测序时间的各组成部分
1.“簇生成”可以使用cBot（自动簇生成系统）或者直接在测序仪上完成，需借助cBot完成簇生成的测序机型为HiSeq系列（HiSeq2500/HiSeq3000/4000/X），但HiSeq2500 快速模式 V2也可以进行机载簇生成。



illumina HiSeq系列测序产品 cBot2 自动化簇生成系统

2.“SBS化学反应与信号采集（测序循环时间）”，这部分由化学反应时间和信号采集时间组成。目前测序仪器制造商主要通过加快化学反应和信号采集速度或减少信号采集面积来缩短测序时间。
3.测序簇模板构建（Template Building），该部分仅存在于使用非阵列式流动槽的测序机型中。“模板构建”是指“Real Time Analysis，RTA”实时分析软件根据前几个Cycle测序簇发出荧光信号的（x，y）坐标来确定其在流动槽上的具体位置的过程，以MiSeq V3为例，RTA软件会使用前7个Cycle来完成测序簇的“模板构建”工作，“模版构建”完成后，后续每个测序循环生成的图像将与该模板进行比对并提取Cluster的信号强度（Registration and Intensity Extraction）用于后续的碱基识别。该过程所需时间与簇密度（Cluster density，CD）相关，簇密度越高，则“模板构建”所需的时间越长。采用“阵列式流动槽”的测序机型则无需再进行“测序簇模板构建”，测序簇只能生成在流动槽的阵列位点上。



Cluster Template Building示意图

4.“二链生成”，该部分仅限于双末端测序模式下。
5.快速清洗与维护清洗，仪器测序完成后均需要对流体系统进行清洗工作（采用集成式卡槽设计的iSeq100和NextSeq1000/2000无需清洗），不同的测序机型的所需的清洗时间、清洗试剂不同。
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