透氧热塑性塑料聚甲基戊烯在长期芯片细胞培养和芯片有机器件中的应用(下)

微流控芯片

3.结果和讨论

3.1.PMP和玻璃细胞形态和增殖的比较

图5比较了标准玻璃盖玻片和抛光PMP膜上的细胞培养，两者在细胞接种前都涂有聚-L-赖氨酸。第一天的图像显示，粘附在两个表面上的细胞数量和细胞粘附开始的时间点相似。通过融合发展判断的细胞增殖率也是可比的，两种材料上的细胞形态也是如此。48小时后的钙黄绿素AM染色证实，在实验结束时，细胞以相似的数量存活。

由于聚苯乙烯制成的细胞培养板和玻璃盖玻片是用于细胞培养和成像的最常见材料，因此对可能的新材料进行基准测试非常重要。对于聚苯乙烯孔板和通常的玻璃盖玻片，PMP也必须进行表面处理以促进细胞粘附。在初步研究中，我们比较了未经治疗的PMP、经血浆治疗的PMP，经聚-L-赖氨酸治疗的PMP和经血浆加聚-L-溶血素治疗的PMP。在未经处理的PMP上，细胞几乎不粘附，细胞形态圆润收缩。Slepička等人和Michaljaničová等人也分别对血管平滑肌细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（NIH 3T3）进行了观察。在三种治疗中的任何一种的PMP上，细胞粘附、增殖和形态与图5相似。

等离子体处理通常用于增加聚合物的亲水性，从而增加细胞粘附和增殖。它也是制造用于贴壁细胞的商业聚苯乙烯细胞培养板的最常见方法。Slepička等人和Michaljaničová等人研究了PMP等离子体处理的变体，以提高该材料在组织工程中的细胞相容性。Slepićka等人使用低功率（3和8 W）的Ar等离子体，而Michaljaniičová等人使用高功率的氩或O2/Ar等离子体。其他参数也有所不同。对于所有血浆处理的变体，他们表明，与接触角约为100°的未处理PMP相比，水接触角显著降低，细胞在血浆处理的PMP上成功粘附和增殖，而非未处理的PMP。然而，他们还表明，在等离子体处理后，接触角在接下来的几天内再次逐渐向未处理值增加。对于Slepička等人进行的低功率等离子体处理，恢复到更高接触角的速度比Michaljaničová等人进行的更高功率等离子体处理快，其中一些样品保持在60°接触角至少9天。除水接触角之外的其他因素也可能影响细胞粘附，需要更多的研究来了解所有实验参数随时间的相互作用。对于将PMP用于OoC和长期片上细胞培养，血浆处理产生处理后多年稳定的PMP表面，就像今天商业TCPS板的情况一样，将是非常有益的。这将简化芯片实验室社区工程师和生物学家之间的合作，使实验更加实用，并允许大规模生产即用型设备。

在这项工作中，由于与实验工作流程的更好兼容性，聚-L-赖氨酸处理被选为提高PMP细胞相容性的方法。

3.2.透射光和荧光共聚焦显微镜的适用性

在用于长期细胞培养和OoC应用的微流体设备中，能够用显微镜连续监测细胞状态至关重要。由于荧光染色和成像可能因光毒性而随着时间的推移对细胞有害，并且只能使部分细胞可见，因此透射光显微镜是首选的细胞监测方法。图5表明，在玻璃和PMP上成像时，细胞的外观相似，因此PMP的光学特性适用于该应用。

商用PMP薄膜被挤出，一面有光泽，一面无光泽。据我们所知，目前市场上还没有完全透明的PMP薄膜。尽管荧光成像在这些商业胶片上是可行的，但粗糙度较高的亚光面会干扰透射光成像，从而无法进行可靠的细胞观察。这在补充图S3中得到了证明。为了获得适用于显微镜的PMP薄膜，应用了亚光侧的抛光方法。抛光过程可以进一步优化，以防止由于施加的机械力而偶尔划伤和弯曲PMP膜。

本文首次报道了在PMP上生长的活细胞的透射光图像。Slepička等人和Michaljaničová等人展示了在血浆处理的PMP上生长的细胞的荧光图像，这些细胞被固定并荧光标记，但没有伴随的透射光图像。Nishikawa等人和Danoy等人分别在I-P型胶原蛋白包被的PMP上培养原代大鼠肝细胞和冷冻保存的原代人肝细胞，以更准确地评估肝细胞代谢和药物筛选。然而，透射光显微镜图像没有如本文所示。我们不知道其他在PMP上培养细胞的工作。如上所述，在微流体装置中细胞培养过程中用于细胞监测的透射光显微镜至关重要，因此，我们认为这里提出的结果是阐明PMP适用于片上器官和长期细胞培养装置的重要一步。

为了详细研究细胞机制和反应，共聚焦显微镜等高分辨率成像技术是必要的。在PDMS中制造的常见微流体细胞培养装置的一个主要挑战是，由于材料的高弹性，需要毫米范围内的装置厚度来获得足够的刚性，以实现稳健的通道几何形状。为了进行高分辨率成像，通常需要小于0.3毫米的工作距离，因此毫米厚的PDMS设备是不切实际的。当试样与盖玻片直接接触时，大多数物镜都设计为与厚度为0.17 mm的玻璃盖玻片（盖玻片#1.5）一起工作。在我们的工作中，我们使用了厚度最接近此厚度且薄至0.125 mm的市售PMP薄膜。由于PMP是一种热塑性材料，即使在这种厚度下，其刚度也适合构成坚固、平坦的通道壁，从而允许共聚焦显微镜，如图5所示。根据制造商Mitsui Chemicals，股份有限公司的说法，PMP像玻璃一样透明，对可见光具有优异的透过率（>93%；雾度<5%）。此外，PMP在紫外线范围内显示出比玻璃更好的透射率。总之，PMP似乎非常适合细胞成像，以及更专业的高分辨率成像技术，如共聚焦显微镜。

3.3.与细胞培养和显微镜样品制备常用化学品的兼容性

用于细胞培养的微流体装置中的材料的另一个重要特征是与细胞实验中使用的常见化学物质的相容性。由于其稳定的C-C键，PMP显示出优异的耐化学性，特别是对酸、碱和醇的耐受性。PMP暴露于4%甲醛和0.1%Triton X-100进行细胞固定和渗透，此外还暴露于Aerodesin 2000、70%乙醇和100%甲醇进行灭菌。Aerodesin 2000由32.5重量%的丙-1-醇、18重量%的乙醇和0.1重量%的戊二醛组成。我们没有观察到PMP薄膜在暴露于任何这些化学物质后有任何明显的劣化，也没有观察到其透明度有任何变化。这同样适用于所测试的物理灭菌方法，即等离子体处理、紫外线照射和蒸汽灭菌。事实上，PMP是一种注定要用于需要蒸汽灭菌的应用的材料，因为吸水率非常低，因此无法观察到水解引起的尺寸变化。

图6显示了除DAPI核染色外，用抗HIF-1α抗体和Alexa 488标记的二抗固定、渗透和荧光标记的细胞的共聚焦图像。这证明了PMP材料与固定和渗透化学物质的相容性及其对荧光成像的适用性。DAPI和Alexa 488荧光分别在358/461 nm和488/520 nm处具有激发/发射最大值；然而，根据三井化学股份有限公司的说法，PMP的透明度应允许在整个可见光范围内获得与玻璃类似的结果，并且在紫外线范围内具有比玻璃更好的透射性。如图5和图6中的荧光图像所示，我们没有观察到任何荧光团与PMP膜的非特异性结合。基于此，我们可以得出结论，PMP在化学相容性方面适用于长期微流控细胞培养装置。

3.4.设备制造

在这项工作中，实验需要一种装置，其中气体流入受到透气底壁的限制，而装置的其余部分则由不透气材料（PC）制成。为此，使用PSA手动对齐PMP薄膜并将其与铣削的PC基板层压在一起（图2）。这种简单的原型制作方法产生了功能良好的概念验证设备。然而，对于许多OoC应用，需要在PMP中制造整个器件，因此，需要替代的制造和粘合方法，例如铣削和注塑。

3.5.足够的气体渗透性以维持密封装置中的细胞培养，而无需灌注培养基

在实验过程中，每天至少两次通过显微镜监测细胞生长。由于氧传感器点覆盖了腔室的中心，因此在密封设备时只能监测腔室外围的细胞，但在实验结束时（第四天），打开设备检查整个细胞培养区域。所有设备中细胞融合的发展情况相似，表明玻璃设备与PMP和PDMS设备中O2浓度的差异不是由PMP和PDSS设备中细胞数量较低引起的。

所有三种设备中O2浓度的趋势都很明显，并且随时间的波动很小。在图7中，绘制了实验精确测量值的平均值和标准偏差。因此，结果中存在相对较大的标准偏差，特别是在带有玻璃盖玻片的设备的第一天。然而，相对较大的标准偏差不是由同一室内O2浓度的时间依赖性波动引起的，而是由实验重复之间的差异引起的。

经过四天的细胞培养和O2浓度监测，打开所有装置，固定细胞，使其透性，对HIF-1α进行染色并检查（图6）。我们观察到在带有玻璃盖玻片的设备中生长的许多细胞中HIF-1α的激活，根据O2浓度测量，实验结束时氧浓度降至约3%。在含有PMP的设备中生长的细胞中看不到这种激活，最终测量的氧浓度达到16%。这与Uchida等人的研究结果一致，其中在氧气浓度降低的范围内，A549细胞中HIF-1α的水平在氧气浓度为3%时首先上升。由于夹板阻碍了显微镜物镜的进入，因此无法在带有PDMS薄膜的设备中获得细胞的共聚焦图像。

尽管PMP膜在当前的工作中提供了足够的气体供应，但这并不一定意味着这适用于用于微流体细胞培养和OoC的所有设备几何形状和细胞类型。根据Wagner等人的研究，哺乳动物细胞在培养中的氧气利用率范围为<1至350 >amol cell-1 s-1，取决于细胞类型、功能和生物学状态。根据同一篇论文，本研究中使用的A549细胞的OCR为27 amol cell−1 s−1。每单位面积的细胞数量取决于细胞大小、生长特性，重要的是该设备是用于2D还是3D培养。PMP中氧气的渗透性可能因不同等级的PMP而异，并可能受到聚合物原型方法的影响。装置几何形状，即壁厚和由透气PMP制成的装置的百分比，在不同的应用中也可能存在很大差异。因此，需要更多的研究来进一步研究PMP对不同细胞类型、细胞培养形式和微流体装置几何形状的适用性。Ochs等人的工作中发现了不同细胞类型影响的一个例子，其中测量了结合到不透气氧气传感器箔上的2毫米厚COC、PMP和PDMS器件中的氧气浓度。对于内皮细胞，PMP和PDMS装置的氧气浓度均保持在15-16%，而在COC中，氧气浓度在监测的2小时内降至12%。对于肝细胞，只有PDMS装置维持了16%的氧气，而PMP和COC装置在2小时内分别降至9%和4%。

为了更好地了解本项目开发的培养室模块中不同细胞类型的PMP气体供应是否充足，进行了分析。使用补充信息中提供的通过培养基（1）和PMP材料（2）的氧气通量方程，我们将传统细胞培养中的氧气通量与开发的培养室模块中的氧气流量进行了比较。。计算表明，在常规96孔板中，通过PMP膜的氧气通量分别是通过100µL和200µL介质的10倍和20倍。100–200µL是96孔板中使用的标准体积范围。这意味着，当在2D标准培养基体积的常规孔板中培养时，任何具有足够氧气供应的细胞系在开发的培养室模块中类似培养时，都应该有足够的氧气供应。

4.结论

在这项工作中，我们评估了PMP材料的各种性能，并表明该材料非常适合长期细胞培养和OoC设备。最重要的是，我们已经证明，在A549细胞培养4天的密封培养室中，PMP在供氧方面与PDMS具有相当的性能。对于这两种材料，氧浓度稳定在16%，而玻璃的氧浓度降低到3%。分析表明，在96孔板中，通过PMP薄膜的理论氧气通量比通过100和200µL介质的通量高10倍和20倍。因此，在标准条件下培养的任何2D细胞系在所提供的培养室模块中都应该有足够的氧气供应。通过装置材料本身的充足气体供应能够使氧气供应与培养基灌注脱钩，从而降低灌注速率并减少细胞上的剪切应力。这最终允许更好地控制OoC设备中的细胞微环境。

我们还发现，A549细胞在PMP膜和涂有聚-L-赖氨酸的玻璃盖玻片上的细胞粘附、增殖、形态和存活率相似。我们首次展示了在PMP上生长的细胞的透射光图像，证明了PMP的光学特性适用于非荧光活细胞成像。与PDMS相反，PMP由于其良好的光学性能和刚度，即使对于薄至0.125µm的薄膜，也非常适合高分辨率共聚焦显微镜。此外，我们发现PMP与物理和化学设备灭菌（蒸汽灭菌、等离子体处理、紫外线、乙醇、甲醇和Aerodesin 2000）、细胞固定（甲醛）和渗透以及荧光染色兼容。

总之，PMP对于用于长期细胞培养的微流体装置具有许多优点。随着器件原型的进一步发展，我们相信PMP将在未来几年在该领域发挥重要作用。

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