ELISA试剂盒如何选择？

007

ELISA试剂盒如何选择？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/510978009

长长的路

ELISA是实验室里一项最基本的免疫检测技术，被广泛应用科研、医疗、食品和环境等领域。面对市场琳琅满目试剂盒及数百家供应商，对于刚进入实验室的新手或者准备开展ELISA实验人员，如何选择一款合适的ELISA试剂盒呢？下面我们从elisa类型、实验物种及待检样品、样品中检测物水平、样本可获得性、试剂盒关键性技术参数和预算。




通蔚ELISA试剂盒

目录：

  1.ELISA类型

  2.实验物种及待检样品

  3.样品中检测物水平

  4.样本可获得性

  5.试剂盒关键性技术参数

  6.预算

  一、ELISA类型


  在进行ELISA实验时，首要是明确ELISA类型。实验人员可以结合自己待检测物来明确试剂盒类型。一般试剂盒类型分为直接法、间接法、竞争法和双抗体夹心法。下面详细介绍：

  1.直接法：直接ELISA步骤最少，常用于分析对抗原的免疫反应。

  2.间接法:间接ELISA是一个两步过程，最适合确定样本中的总抗体浓度。

  3.夹心ELISA（适用于大蛋白）利用匹配的抗体对，灵敏度比间接或直接ELISA高2-5倍。用于分析复杂样品，因为抗原在测量前不需要纯化。

  4.竞争性ELISA（适用于小蛋白质）最适合检测不能被两种不同抗体结合的小抗原，例如夹心ELISA技术。

  二、实验物种及待检样品


      如果实验对象是人、小鼠及大鼠比较常见物种，选择一个合适的试剂盒相对容易一些。如果检测样品比较稀有的鸡、牛、猴物种，市面上还是比较少。如果需要的话，最好要对待检物（如有种属差异性）进行同源性分析以及试剂盒的种属交叉反应数据。

      对于样品类型而言，一般的商业化试剂盒在正式上市销售之前都经过血清、血浆和细胞培养上清液的验证。

  在选择试剂盒之前，最好是详细阅读说明书。因为在某些情况下样品会存在感染因素。例如溶血血浆、含有高脂肪的样本、细胞培养液或人抗属抗体中含有胎牛血清等。通过阅读供应商说明书或直接进行咨询。如果您的样品为组织和细胞裂解物，则需要谨慎的选择试剂盒。

  三、样品中检测物水平


  为了降低目标蛋白之外的其他成分（例如盐离子、脂类、其他蛋白质等），一般建议至少进行2倍稀释，也就是将1份样品与1份稀释液混合。如果对样品浓度范围没有概念，最好先做预实验，测试不同稀释倍数下的结果，找到最佳稀释倍数。除此之外，样品中待检测物含量远超试剂盒检测范围（标曲范围），需要根据样品中目标蛋白的大概浓度和试剂盒的检测范围，选择合适的稀释倍数。最后计算结果时，需要将测得的数值乘以相应的稀释倍数，才能得到样品中目标蛋白的真实浓度。

  四、样本可获得性


  一般而言，商业化试剂盒的样本用量都在50ul或100ul，但也有一些供应商的试剂盒样品用量要求可少至于10ul。如果您待检测样品比较难获取，则需认真考虑试剂盒对样品用量的需求。如果样品本身就比较少，且需要做多因子检测时更需要谨慎选择。

  五、试剂盒关键性技术参数


      ELISA试剂盒关键的技术参数包括板内差异性、板间差异性、批间差异性、重复性、特异性及交叉反应性、回收率等。如果经常开展ELISA实验，建议使用同一厂家试剂盒，这样可以保证实验数据的可比性和重复性。

  六、预算


  预算是选购ELISA试剂盒比较关键的环节。国际公认知名品牌（进口试剂盒）质量比较可靠，文献引用较多。由于知名品牌（进口）运输成本较高，试剂盒价格也较高。对于国内优质品牌试剂盒也是不错的选择，因因省去不少物流和报关中间费用，与进口试剂盒价格上相比也有较大的优惠，而且能够提供灵活的包装规格，比较适合国情。

  以上就是通蔚为大家介绍ELISA试剂盒选择方法，广大科研人员选择试剂盒务必仔细研究，谨慎购买。如果您对ELISA试剂盒还有疑问，欢迎前来私信通蔚顾问。

继续前进

在选购ELISA试剂盒时，重要的参数有灵敏度、动态范围和精度，多数ELISA试剂盒都有相关报告。对于典型样本类型，其他参数对ELISA性能更具预测价值。例如在血浆、血清或细胞培养液等实际样本中测量靶蛋白的回收率（%）及稀释线性度。

选择ELISA试剂盒时需要注意的参数如下：

参数	标准
灵敏度	取决于检测靶蛋白
检测范围	取决于检测靶蛋白
批内精密度CV（%）	<=10%
批间精密度CV（%）	<=15%
特异性	检查与高度同源性蛋白的交叉反应性
回收率	80%~120%
稀释线性	80%~120%

大力水手

酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA或EIA)是一种检测和定量生物样本中蛋白质含量的实验室方法（1,2）。



图 夹心法ELISA分析原理（From Candor Bioscience）

在选择ELISA试剂盒时，研究人员经常面临这样一个问题，即选择许多市售的试剂盒。这可能是一个挑战！这里有一些可能会有帮助的提示。
一般来说，在购买一种试剂盒之前，一定要详细阅读产品使用手册）。这可以确保该试剂盒是否适合您的要求。建议查看以下内容：
1.分析物

你要检测哪个蛋白质生物标志物？请确保在搜索过程中使用正确的术语。一些生物标记物有不同的名称(例如，Sclerostin 或SOST ELISA（SOST实际上是编码Sclerostin的基因的名称）。
2.物种-特异性-交叉反应性

验证该检测方法是否可用于各自的模型，如人、大鼠或小鼠。由于物种之间的高度同源性，一些ELISA试剂盒在人类和不同的动物物种中都有效。例如，生物标志物NT-proANP ELISA试剂盒被开发用于人类使用，但由于物种间的高序列同源性，该试剂盒也被成功地用于检测其他各种动物模型（大鼠、小鼠、兔、猴子）的心脏安全生物标志物NT-proANP。
3.样本类型

您将使用什么样本类型（基质）（例如：血清、EDTA血浆、肝素血浆、柠檬酸盐血浆、细胞培养上清液、尿液等）？
查看产品使用手册，确认该试剂盒是否与您的样品类型兼容。如果是，则查看是否有显示结果的验证数据（通常可以在厂家的网站或说明书内找到）。
值得注意的是：分析“错误的”基质类型中的一些生物标记物可能会由于基质效应而导致“错误的”的结果。
4.样本量

检查每孔所需的样品量（计算体积以重复测量样品）。低样本需求量往往是选择标准，尤其是样本珍贵的情况。
5.灵敏度——可检测的生物标志物浓度

在选择试剂盒之前，请查看试剂盒的验证数据（通常记录在ELISA操作手册中）。
血清和/或血浆中的参考值和病理值有时也被记录下来。这些数据有助于选择一个合适的检测方法。在某些情况下，样品可能需要预稀释。因此，一定要确认稀释缓冲液（检测缓冲液）是否包含在试剂盒中，或要求检测人员自备。
值得注意的是：提供高灵敏度试剂盒相较于低灵敏度的试剂盒，提供了不同的动态范围。检测的动态范围表明试剂盒可以精确定量分析物的浓度范围。
6.试剂盒性能-分析方法验证

在选择ELISA试剂盒时，仔细评估该试剂盒的性能特性是很重要的。
选择一个已经经过严格验证过程的试剂盒，检查一下，您是否能找到有关以下性能特征的数据：

• 临床样本中蛋白质生物标志物的准确性检测。
  
• 稀释线性和相关度：在稀释样品中感兴趣的分析物的回收率
  
• 特异性和交叉反应性：确保你只检测到感兴趣的分析物
  
• 精度：组间组内检测精度-确保跨检测批次内的精确和可重复的结果
  
• 校准：确保在校准曲线的测定范围内的性能一致
  
• 样品稳定性：确保目标分析物的稳定性（例如，真实样品暴露于多次冻融循环，室温下的稳定性…）。
  

7.试剂盒组分

确认ELISA试剂盒的内容是否包括所有必要的成分，如对照品、测定稀释缓冲液。考虑储存要求，如温度敏感性和有效期。
8.文献引用

检查在厂家的网站上是否有关于特定的ELISA试剂盒的引用文献数据。查看出版物，如果可能可以从使用过你正在考虑的试剂盒的研究人员那里寻求反馈。
9.产品来源

确认试剂盒供应商是否即为试剂盒生产商。越来越多的试剂盒被重新包装，并以不同的品牌名称出售，尽管它是相同的试剂盒。
ELISA试剂盒生产商更有可能为您提供合格的支持，因为他们“知道”他们的产品（例如，可获得额外的校准品、对照品、缓冲液..，专业技术知识等）。
10.客户支持

验证试剂盒供应商是否能够提供及时和有益的客户服务。

Biomedica Immunoassay作为全球知名ELISA试剂盒生产商，有着近40年的研发生产经验，可提供骨代谢、心血管、肾病等相关疾病生物标志物的ELISA试剂盒。Biomedica的产品根据FDA、EMEA、ICH指南进行验证，并提供验证报告。生产流程符合GMP/GLP指南，并符合ISO 9001:2015管理体系。Biomedica免疫分析已获得国际认可，客户包括众多顶级机构、知名CRO和制药行业的实验室。欢迎垂询Biomedica Immunoassay中国区授权代理商——青木生物技术（武汉）有限公司。
✿ 特色产品推荐 ✿

NT-proANP ELISA
样品需求量少 – 10 µl / well
适用于多种种属 – 人、小鼠、大鼠
可检测多种样本类型 – 血清、血浆（EDTA plasma, citrate plasma, heparın plasma）、尿液、细胞培养上清
文献引用多 – 超150篇

Osteoprotegerin ELISA
高灵敏度 – 低至0.07 pmol/l (= 1.4 pg/ml)
引用文献最多的人OPG ELISA试剂盒 – 超250篇

Human DKK1 ELISA Kit
样品需求量少 – 20 µl / well，且无需额外稀释
检测范围广 – 43-4102 pg/ml
文献引用多 – 超180篇

FREE soluble RANKL HS ELISA
高灵敏度– 低至0.2 pg/ml，即使是健康样本中的RANKL含量也可检测出来
只检测游离可溶性的RANKL
文献引用多 – 超300篇

相关文献

1.Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: Types and Applications. Hayrapetyan H, Tran T, Tellez-Corrales E, Madiraju C. Methods Mol Biol. 2023;2612:1-17. doi: 10.1007/978-1-0716-2903-1_1. PMID: 36795355.
2. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Lequin RM, Clinical Chemistry. 2005; 51, 12:  2415-2418.

卡卡

这个问题很多人都会遇到，而且或多或少都会踩一些坑~
我用我多年的采购经验告诉你，认真看完这篇文章，你将学会区分ELISA试剂盒的好坏。这也是科研人的必备技能，毕竟优秀的ELISA试剂盒产品将极大地促进我们实验进度，帮助我们拿到珍贵可靠的实验数据。
在市场上，根据国内外各大科研院所科研人员和行业内广大厂家的共识，ELISA试剂盒通常被分为低端、中端和高端三类。以下这7个指标，就是衡量ELISA试剂盒的好坏标准。

最全的生物实验protocol与生物实验操作视频学习资料（细胞功能分析、蛋白组学、病例组化、分子生物学）
112个科研软件免费版（数据处理+绘图+翻译+生物实验相关等）
下载链接：https://pan.quark.cn/s/34a75dd2

首先，你需要明确实验目的是做靶标功能性测定还是含量检测。功能性测定一般是酶及底物的反应，对生物活性的分析。而Elisa专用于靶标分子的含量检测。
其次，如果所研究指标为蛋白质或多肽，可以到Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)查询对应的的Uniprot ID，在选择产品时同时核对指标名和Uniprot ID；如果所研究指标为小分子半抗原，此类化学物质可以到ChemSpider化学品库(http://www.chemspider.com)查询对应的CAS号，结合CAS号选择需要的产品。
然后，我们还需要根据已有文献查询或预判靶标在生物样本中的有无或含量区间，针对性选择灵敏度足够的试剂盒，同时和厂商确认试剂盒的适用样本是否包含客户自己的实验样本。
在此基础上，如果有多种品牌的同类产品可以选择，还应比较试剂盒产品的多项性能参数，包括灵敏度、特异性、精密性、准确度、线性、稳定性、天然样本数据。这些参数是ELISA作为一种人为建立的微量分析方法为确保其有效性和可信度所必须考量的内在固有的特性。


01 灵敏度(sensitivity)


灵敏度(sensitivity)—试剂盒对于被检物质的最低检测能力，如果我们待检物质浓度量很低，可以选择高灵敏的试剂盒。灵敏度取值为空白对照的标准差对应的浓度值的3倍。
02 特异性(Specificity)


特异性(Specificity)—判断其他分子与试剂盒抗体的结合能力。交叉反应越小，试剂盒的特异性越好。一般需要衡量试剂盒与当前种属同家族蛋白和其它种属该蛋白、血清中常见因子(如异嗜性抗体、类风湿性因子等)、靶蛋白互作蛋白无交叉反应。



03 精密性(Precision)


精密性(Precision)—也叫重复性，是对同一样品重复测定时误差大小的评估参数。一般要求板间及板内精密性控制在10%以内。菲恩生物使用全机器生产，排除人工的不稳定性，依靠电子移液枪和自动包板机精确加样，严格控制批内差批间差。

04 准确度(Recovery )


准确度(Recovery ) —一般通过加标(spike-in)回收率来衡量，回收率在80%-120%之间为合格。通过添加标准品到天然样本基质内进行测定，以不添加标准品的天然样本基质为空白对照，回收率数值为靶标的测定浓度与添加的标准品浓度比值，以百分比计。回收率偏高或偏低会产生假阳性或假阴性结果，影响测定值的准确性。



05 线性(Linearity )


线性(Linearity ) —在天然样本基质中添加有适当浓度的标准品，分别稀释2倍、4倍、8倍来检测，测定各浓度下的回收率，回收率在80%-120%之间为合格。



06 稳定性(Stability )


稳定性(Stability ) —一般以加速破坏性实验进行验证，将未拆封的试剂盒在37°C和2-8°C分别放置一定时间，考察各项性能指标的偏差，以偏差小于10%为合格。稳定性越好，试剂盒存储时间越长。

07 天然样本检测


最后，还应明确试剂盒可以检测天然样本及合适的样本类型。根据靶点性质预判适合检测的样本，并实际检测该类样本数量达到5例以上，在客户需要时提供一定的样本含量数据参考。

最后，关于ELISA的实验操作，可以看这个视频，从实验原理到实验操作、结果分析再到实验答疑，都讲的很好。如果你正在学习ELISA实验，建议下载学习。
链接：https://pan.baidu.com/s/1z-IMTdTZNaMI12HYye27Bg?pwd=cmd2
提取码：cmd2



推荐内容

绝密！2023年国自然立项清单表可下载（生命科学部+医学科学部），附往年1000+份中标标书！
如何查看国家自然科学基金的的摘要和下载结题报告？
有哪些好用的zotero插件?
有什么适合药学/生物方向科研小白的简单易学的科研绘图工具？
有没有什么很好的科研作图软件？
顶级图像分析软件，Image J、Fiji、Image pro plus，一次帮你搞定！
NoteExpress和EndNote相比哪一个更好用？（附安装包）
2023年更新！EndNote X9永久激活版本（序列号激活），最稳定，可汉化！
写的太全了，Endnote 插入文献以及调整参考文献格式，这是知乎上最好的教程！
太牛了！Zlibrary回归，这里有最稳定的访问指南！
western blot是为了什么？
如何学习和记忆细胞信号通路？
最值得推荐装！GraphPad Prism 9.3 ，功能更多！
SPSS 27 安装激活，授权日期到期时间2037年

长长的路

要问科研最怕遇到的糟心事，非买到假冒科研试剂莫属了，用假冒试剂无非导致两种结果：实验失败or被动学术造假。ELISA试剂盒门槛较低，制假相对简单，常有不法商家打着种属全、指标全、现货供应的旗号来生产、销售假冒ELISA试剂盒，曾有老师吐槽“每个月都能收到好几个从未听过的厂商向我推销ELISA试剂盒”。针对ELISA试剂盒真假问题，我们整理了一些辨别经验（购买前and购买后），希望对大家有所帮助。

购  买  前

1．选择正规公司
进口试剂盒尽量选择Thermo、 R&D等知名公司；国产试剂盒一定要选择大型正规企业，比如联科生物。将“厂家名”、“ELISA”和“假货”等关键词在网上搜索，有的网站或论坛如丁香园等会有打假曝光平台。正规厂商的ELISA试剂盒通常有技术发明专利支撑和ISO9001国际质量体系认证，且厂家会定期收集整理试剂盒的文献引用情况，购买前可向厂家索要相关材料加以核实。

2．试剂盒性能参数
向厂家索要或从其官网下载产品说明书和质控报告，查找ELISA试剂盒的关键质控性能参数：准确度(加标回收率、稀释线性)、精密度(板内差、板间差)、灵敏度、样本值、特异性、校准。如果无法提供这些性能参数数据，则说明试剂盒开发过程不够科学严谨，并未做试剂盒性能测试从而无法得到准确真实的结果，也有极大可能是假货试剂盒。

3. 不常见指标的选择
如需检测不常见物种的样本(如禽类、猪、羊等)，可选择靠谱的生物网站或知名ELISA试剂盒供应商。其实，“货比三家”有时会有一些“惊喜”，也许你会发现：某个公司的说明书除了指标名称不一致，其他内容基本一样；某个指标，几家公司试剂盒的性能参数完全一样…一定要记住：关于网上宣传有所有种属所有指标ELISA试剂盒的公司，那真的是再谨慎也不为过。

4. 所有指标常备现货
抗体并不十分稳定，针对非热门研究指标，厂家为保证产品质量通常不会长期备现货，若承诺相对冷门的ELISA试剂盒能随时发货，那需谨慎考虑是否要选择该供应商。

购  买  后

1．检查
检查说明书、包装盒的质量，通常假冒伪劣产品为了降低成本，印刷的质量会比较差。其次仔细阅读说明书，如上所示查找ELISA的性能指标。

2．实验
（1）利用干扰实验即可鉴别ELISA试剂盒是否检测目的抗原
a. 将针对试剂盒特异性的重组蛋白抗原和试剂盒中的检测抗体配置成antibody: antigen= 1:2的混合孵育液；
b. 37℃孵育15分钟后，代替原试剂盒中的检测抗体；
c. 后续操作按照试剂盒说明书进行，加检测抗体、酶复合物和底物；
d. 实验完毕后，检测其标准曲线，如果标准曲线良好则说明加入的目的抗原和试剂盒抗体不匹配，试剂盒检测抗体针对的是非目的抗原，该试剂盒为假货ELISA试剂盒；
e. 如果标准曲线无线性，则说明试剂盒检测抗体已被目的抗原中和或干扰，影响了其实际试剂盒抗体的检测作用，则该试剂盒检测抗体针对的是目的抗原。

（2）如果购买了两盒同一公司的ELISA试剂盒A和B，利用交叉实验即可鉴别ELISA试剂盒是否造假
a. 取出购买的试剂盒A的包被板两条；
b. 一条包被板加试剂盒A的标准品做标准曲线；
c. 另一条包被板加试剂盒B的标准品做标准曲线；
d. 后续操作按照试剂盒说明书进行，加检测抗体、酶复合物和底物；
e. 实验完毕后，检测两条标准曲线，如果两条标准曲线一致则说明两个ELISA试剂盒检测的同一个指标而非A和B，即该试剂盒为假货ELISA试剂盒；
f. 如果两条标准曲线不一致则说明两个ELISA试剂盒检测的不同指标，试剂盒A只能检测A，不能检测B，即该试剂盒为正常的ELISA试剂盒。