RNA提取（Trizol 法）

病理医师

用Trizol 溶液提取，将总RNA与 DNA 和蛋白质分离。Trizol 是一种酸性溶液，含有硫氰酸胍 (GITC)、苯酚和氯仿。GITC 不可逆地使蛋白质和 RNase 变性。随后进行离心。在酸性条件下，总 RNA 保留在上层水相中，而大部分 DNA 和蛋白质保留在中间相或下层有机相中。然后通过用异丙醇沉淀回收总 RNA。
RNA提取操作步骤
准备试剂：氯仿（避光，提前预冷）、异丙醇（避光，提前预冷）、RNase-Free ddH2O 、75%乙醇（使用RNase-Free ddH2O 配制，提前预冷）。
准备仪器：离心机（提前打开，4℃预冷），研磨仪（组织会用到，提前打开，-30°预冷）
1. 样品处理
a. 植物组织：以叶片RNA提取为例。取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接 在TRNzol试剂中研磨，研磨要迅速，最好不要超过1 min。大约100 mg叶片使用1 ml TRNzol试剂。
b. 动物组织：以猪肝脏RNA提取为例。取新鲜或-70℃冻存组织，每30-50 mg组织（我们一般用50mg，但不一定很精确，可能多也可能少）加入 1 ml TRNzol试剂，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过TRNzol试剂体积的10%。
c. 单层培养细胞：单层贴壁细胞的收集（收集细胞数量请不要超过1×107 ）：可直接在培养容器中裂解（容器体积不超过10 cm2 ）,或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。（在摇瓶中培养的单层贴壁细胞通常采用胰蛋白酶处理的方法）。
1) 直接裂解法： 直接在培养板中加入TRNzol试剂裂解细胞，每10 cm2 面积加入1 ml TRNzol试剂。用取样器吹打几次。
注意：TRNzol试剂加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果TRNzol试剂加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。
2) 胰蛋白酶处理法：确定细胞数量，吸除培养基，用PBS洗涤细胞，吸除PBS，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁时，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至RNase-free的离心管中，300×g离心5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清。
注意：收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA的产量降低。
d. 细胞悬液：离心取细胞。每5×106 ~1×107 动物细胞和植物细胞加入1 ml TRNzol试剂。加入TRNzol试剂前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。
2. 将匀浆样品在室温放置5 min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
3. 可选步骤：4℃ 12,000 rpm(~13,400×g) 离心10 min，取上清。 （一般我们提细胞或者大部分组织的RNA时不考虑这一步骤）
注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。 离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组 织样品时，上层是大量油脂，应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4. 每使用1 ml TRNzol试剂加200ul氯仿（有机溶剂，不溶于水，RNA为离子化合物，溶于水相），盖好管盖，剧烈振荡15 s，室温放置 3 min。
注意：如不能旋涡混匀，可手动快速颠倒混匀2 min
5. 4℃ 12,000 rpm离心15 min。样品会分成三层：粉色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500 μl，但是我们一般都会取400ul，以免不小心吸到中间层，造成蛋白质污染）转移到新的离心管中。
6. 在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇（能夺取RNA周围的水分，使得RNA能够聚集而发生沉淀），混匀，室温放置10 min。
7. 4℃ 12,000 rpm离心10 min，去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
8. 加入1ml 75%乙醇（用RNase-free ddH2O配制，可以溶解RNA沉淀中的有机物杂质，可溶解一部分蛋白质）洗涤沉淀。每使用1 ml TRNzol试剂至少用1ml 75%乙醇对沉淀进行洗涤。
9. 4℃ 10,000 rpm  离心5 min。倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。
10. 室温放置晾干（不要晾的过干，RNA完全干燥后会很难溶解，大约晾干2-3 min左右即可），根据实验需要，加入30-100 μl RNase-Free ddH2O，反复吹打、混匀，充分溶解RNA。（一般组织RNA浓度会高一些，所以我们组织会加50ul左右的无酶水；细胞的RNA浓度会低些，我们会加10~20ul左右的无酶水）

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