western blot条带是这样是什么原因？

good · 发表于 2025-3-11 19:40

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western blot条带是这样是什么原因？
原文地址：https://www.zhihu.com/question/52153197

继续前进 · 发表于 2025-3-11 19:40

Western blot实验步骤、操作繁多，原理看似简单，但特别不容易得出符合要求的结果。任何一个环节出错都会导致实验夭折，最关键的是我们只能从最后一步得出的结果才能排除哪个环节出了什么问题，并不像其他实验哪个步骤出现失误可以不用继续后续实验，只需改变当前环节实验方法即可。真所谓“一步错，步步错”。

作为内参基因：control gene 1， control gene 2，条带标准。control gene 3，很明显跑出这样的结果不符合实验要求；定量实验没做好，出现误差。内参基因选择错误，在样本中该内参基因表达不稳定。

1、样本中的指标蛋白降解。如果一种蛋白质既有入核信号又有出核信号的话可能是一种运输蛋白，可以往返细胞核和细胞质，最终可能是在细胞质中降解。由于蛋白的转录调控作用，蛋白出现相应的自噬、凋亡、死亡现象。
2、SDS-PAGE胶最好现用现配，聚丙烯凝胶配置后静置时间过短、过长都会影响蛋白分离效果，一般在垂直电泳操作前50min开始配胶。转膜时间过长，导致蛋白穿过NC膜。
3、转膜时，需要将NC膜与海绵垫之间的气泡进行排除。
4、转膜全程在冰盒上进行，转膜槽电流过大，转膜液在电流下产生微小的气泡使蛋白在转膜过程中被冲散一部分。
5、上样量一般20~100ug，过量在电泳时蛋白无法得到很好的分离。电泳时由于边缘效应会导致条带呈现凹形，改变电泳的电压可以消除这种现象。由于电泳步骤使用的聚丙烯凝胶上、下胶的浓度不一样，电泳最开始阶段采用低压跑10min，再恢复至常规电压进行电泳。
6、特别是从组织中提取蛋白，加入蛋白裂解液后，进行稍微离心，弃微量沉淀。
7、用5%脱脂牛奶封闭时，奶粉颗粒会吸附在膜上。封闭后，用PBS缓冲液漂洗4~5次，每次3min，这个过程不要偷懒、省略步骤。条件允许，可以选用3% BSA进行封闭。
8、避免使用保存时间过长的抗体，是抗体失活还是被污染，都无法判断。
9、Western blot实验中，不要一张膜单独做到底，显影后再漂洗，重新进行下个指标的一抗、二抗孵育。我们要学会和利用裁膜，减轻操作负荷。
10、深入理解实验中的特异性、非特异性，更好的运用抗体的工作浓度。