胶体金技术学习之旅

史忠超建

最近踏入了胶体金技术的学习领域，作为一名初学者，真的是充满了好奇与探索的热情。在初步了解胶体金技术后，深深被它的精妙所吸引，也迫不及待地想和大家分享我的学习心得，更渴望在这个过程中得到各位大神的指点，一起交流，共同提升技术水平。
一、初遇胶体金技术
第一次听说胶体金技术，是在一次科研讲座上。当时就被它在免疫诊断等领域展现出的独特优势所震撼。简单来说，胶体金是由氯金酸在还原剂作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态。这种特殊的胶体金颗粒，可作为标记物用于免疫标记技术，具有操作简便、快速、直观等诸多优点，在临床诊断、食品安全检测等方面应用极为广泛。
为了深入学习，我查阅了大量的资料，从基础的理论知识到实际的实验操作案例，一点点地搭建起对胶体金技术的认知框架。在理论学习过程中，了解到它的显色原理基于光的散射，金颗粒大小不同，呈现出的颜色也各异，这一特性使得我们能够通过肉眼直接观察检测结果，实在是太神奇了！但随着学习的深入，问题也接踵而至。
二、学习中的困惑
在尝试理解胶体金标记抗体的过程中，我遇到了难题。如何确保抗体与胶体金颗粒稳定结合，并且不影响抗体的活性呢？这涉及到诸多因素，如胶体金的 pH 值、离子强度，以及抗体的浓度和纯度等。我尝试在纸上计算各种参数，模拟实验条件，但实际操作起来肯定会更加复杂，很担心一个小细节没把控好，就会导至实验失败。
还有在制备胶体金溶液时，对于还原剂的选择和用量，不同文献有不同的说法。有的推荐柠檬酸钠，有的则提到白磷等其他还原剂，每种还原剂似乎都有其独特的优缺点和适用场景，这让我有些迷茫，不知道该如何根据自己的实验目的做出最佳选择。
在深入探究胶体金技术相关知识时，我留意到微孔聚合物膜在免疫测定中有着关键应用，这与胶体金免疫测定也紧密相关。
微孔聚合物膜在免疫测定中的应用
微孔膜已被证实是开发简单、快速免疫测定系统的理想载体。目前，硝酸纤维素制成的膜是常用材料，其孔径范围广泛，还可通过表面活性剂处理来优化性能，有助于构建灵敏、稳定且可重复的免疫测定方法。
自 1979 年首次证实蛋白质可转移至微孔硝酸纤维素膜并能用抗体检测以来，利用这些高比表面积材料的快速免疫测定技术迅速发展。起初，大量研究聚焦于理解蛋白质与聚合物的相互作用、阻断膜上非特异性结合的条件，以及开发一系列检测方法和策略。如今，已衍生出多种免疫测定系统，可检测众多分析物，膜在夹心和竞争免疫测定中均有应用，能检测大小分子。
膜的类型
免疫测定系统中膜的选择主要取决于三个特性：蛋白质结合能力、孔隙率和强度。膜固定大分子（尤其是蛋白质）的能力至关重要，因为蛋白质是测定中的固相。膜的孔隙率也很关键，因为反应物需通过膜基质以分离结合和游离成分。膜的强度则对设备的制造和最终使用有影响。
经测试具有蛋白质结合能力的聚合物包括纤维素类（硝酸纤维素、醋酸纤维素、再生纤维素）、尼龙和聚偏二氟乙烯（PVDF）。醋酸纤维素和再生纤维素的结合能力对多数免疫测定不足，而硝酸纤维素、尼龙和 PVDF 膜有更高的结合能力范围。
当前多数基于膜的免疫测定使用尼龙或硝酸纤维素。两者均通过非共价方式结合蛋白质，尽管相互作用机制可能不同。尼龙作为聚酰胺，通过静电和电荷相互作用结合蛋白质，而硝酸纤维素与蛋白质的相互作用主要是疏水性质。它们都能以足够的密度和亲和力结合大多数蛋白质（尤其是抗体）以支持免疫测定，且通常无需共价连接固定的反应物。
虽然尼龙可能是首个用于商业免疫测定系统的聚合物膜，但硝酸纤维素已被证明更具通用性，目前是首选膜材。硝酸纤维素的蛋白质结合能力虽低于尼龙，但足以支持灵敏的免疫测定，这使得基于硝酸纤维素的测定能避免尼龙测定中可能导至背景的高水平非特异性结合。硝酸纤维素可制成孔径范围从 0.05 到约 12 µm 的多种产品，相应地提供不同的结合能力和毛细上升速率，有助于反应物在测定中流动。
流通式和侧流式免疫测定
在为免疫测定系统选择特定硝酸纤维素膜时，必须考虑膜在测定中的作用。基于膜的测定主要分为两类。早期的是流通式过滤测定，在制作此类测定时，一种免疫反应物固定在膜表面的特定区域，该膜覆盖在吸收层上，吸收层作为储液器推动样品通过设备。固定后，膜上剩余的蛋白质结合位点被阻断以减少非特异性相互作用。使用测定时，含分析物的样品添加到膜上并过滤通过基质，使分析物与固定的抗体结合。第二步，添加标记的二抗（酶结合物、与有色乳胶颗粒偶联的抗体或有色胶体中的抗体）与捕获的分析物反应完成夹心。或者，二抗可与样品混合后一步添加。若有分析物存在，膜表面会出现有色斑点。这种测定在制造和使用上都很简单。
此类测定中膜的选择取决于多个因素，如测定灵敏度、运行时间和读出方式。膜的孔径是关键因素，孔径为 0.2 到 8 µm 的硝酸纤维素膜已用于流通式测定。孔径越大，表面积越低，蛋白质结合能力也越低，但大孔径膜支持更快的过滤速率，可使测定更快。相反，小孔径膜能创建更灵敏的测定。
标记抗体复合物的大小也可能决定孔径，孔径必须足够大以允许未反应的抗体通过。使用与有色乳胶珠偶联的抗体的测定需要更大的孔径。
最近，侧流式免疫测定系统得以开发，实现只需添加样品的一步测定。在这些测定中，样品添加到设备一端，通过毛细管作用流经设备内材料的间隙空间。在流动过程中，样品接触干燥试剂（通常是标记的二抗），然后与分析物一起迁移到膜上固定抗体的捕获区。未反应的标记抗体继续流过捕获区，通常到达测定终点指示剂。一般来说，这些设备远端的吸收材料有助于将样品吸过设备。
此类系统中的膜必须具备与流通式设备不同的特性。毛细管速率变得更为重要，因为它不仅决定运行测定所需的总时间，还决定任何给定区域的停留或反应时间。为满足这些要求，已开发出孔径高达 12 µm 的硝酸纤维素膜。随着孔径增加，通过基质的毛细上升速度加快。不过，毛细上升速率与距离的关系并非线性，因此沿膜任何点的反应时间可能不同。尽管大孔径硝酸纤维素膜的结合能力大幅下降，但仍保留足够能力支持所有免疫测定。
孔径并非影响毛细管速率的唯一因素。大多数硝酸纤维素膜含有表面活性剂以帮助湿润并作为抗静电剂。可改变膜中表面活性剂的量和类型，赋予相同孔径的膜不同的毛细管速率。
制造考虑因素
硝酸纤维素膜的一个挑战是其低拉伸强度。为提供足够强度，有三种解决方案。一些硝酸纤维素膜可围绕支撑材料（如非织造聚酯）浇铸。最常见的方法是用粘合剂将膜层压到塑料背衬上。第三种方法是直接将硝酸纤维素膜浇铸在塑料支撑上，以消除膜与粘合剂之间可能的有害相互作用，这不仅省去了制造中的层压步骤，还避免了使用粘合剂系统可能遇到的问题。
为保持硝酸纤维素膜的蛋白质相互作用特性，必须妥善储存以保持湿润。干燥的膜不易再水化，会变得更脆，可能失去结合能力。在设备制造前，硝酸纤维素膜应储存在湿度 40 - 60%、温度 18 - 20°C 的环境中。
为在膜上建立可重复、灵敏的测定，必须准确将各种免疫反应物应用到膜上。通常，抗体或抗原以覆盖特定表面积的线或符号形式添加。大多数抗体线宽 1 - 2 mm，产生这样一条线所需的体积在亚微升范围，膜上的应用速率为 0.5 到 1.0 µl/cm。实现这种速率的仪器必须具有可重复性和准确性。一种应用方法是气刷，即让膜以可控速率通过气刷头。第二种可能更优的方法是使用正位移微量移液系统，提供此类系统的制造商包括 Ivek Corp.、BioDot 和 Ismeca USA。
将免疫反应物应用到膜上后，膜的进一步处理分为两类。有时需要干燥或固化步骤以保持试剂的免疫反应性并将反应物固定在膜上，这通常通过干燥膜来完成，有时需在升高温度下进行。第二种后处理方法是阻断膜以防止后续非特异性相互作用。多种膜阻断剂已成功应用，最常见的是蛋白质。膜通常浸入高浓度蛋白质（如白蛋白）中并干燥。其他系统则将阻断剂加入释放垫，与样品一起通过膜，表面活性剂常用于此目的。用蛋白质阻断膜时可能遇到的一个问题是毛细管速率显著下降。
总结
对微孔膜物理性质的表征和改性，以促进其在免疫测定系统中的应用，已催生新一代硝酸纤维素膜。这些膜浇铸在不同支撑物上，具有改性的表面活性剂含量和多种孔径。目前它们用于人类和兽医诊断、食品检测，也正进入环境和农业检测的新测量技术领域，还将在基于分子生物学（遗传）的测定中发挥作用。
了解这些关于微孔聚合物膜在免疫测定中的知识后，我在思考如何将其更好地应用于胶体金免疫测定中。比如在选择膜材和确定膜的相关参数时，怎样与胶体金颗粒及抗体的特性相匹配，从而优化整个检测流程，提高检测的准确性和灵敏度，这又成为了我新的困惑点。
三、期待大神指点
我深知自己在胶体金技术的学习上才刚刚起步，前方的道路还很漫长。真心希望各位在胶体金技术领域经验丰富的大神们，能够在看到这篇博客后，不吝赐教。无论是关于实验操作的技巧，还是对复杂理论的深入解读，亦或是分享一些在实际应用中遇到的问题及解决方案，对我来说都将是无比珍贵的学习资源。
我非常期待能与大家展开交流，一起探讨如何优化胶体金技术的实验流程，提高检测的灵敏度和准确性。比如在结合微孔聚合物膜进行胶体金免疫测定时，如何更精准地选择膜的类型、控制膜的相关参数等。我相信，通过大家的共同努力，我们不仅能够提升自己的技术水平，说不定还能为胶体金技术在更多领域的拓展应用贡献一份力量。期待大神们的留言，让我们一起开启这场技术提升的交流之旅吧！

小桔灯网

很棒的心得。加油。