[测序仪原理] 三代测序：道路千万条，不走PCR （2）：MinION

wolf

这篇笔记是测序仪原理的最后一篇，讲一下三代测序中的纳米孔测序，之后与测序原理相关的笔记将把重心放在建库原理上，但我也有可能会写一篇关于三代测序原理的总结篇，但最近肯定不会写了。
题外话：最近在考虑要不要写质谱...再说吧
纳米孔测序仪MinION是现在最便携的测序仪，最小的版本和人的手掌差不多大，可以直接插在电脑上进行使用。因此，推出MinION的 Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司将其称之为世界上唯一的实时（real-time）测序仪。



纳米孔测序的原理其实很简单：


每个MinION 搭载的芯片中都包含有数百个纳米孔，这些纳米孔通道由两部分构成：解旋酶和蛋白孔（跨膜蛋白）。这些纳米孔被固定在一层具有很高电阻率的多聚物薄膜上。
当我们在薄膜的两侧施加不同的电位，由于纳米孔两侧都浸没在水溶液中，产生的电流可以通过离子的运动通过纳米孔从高电位向低电位流动。
但由于DNA单链在纳米孔中间，离子运动产生的电流会时不时地被碱基“卡”一下，导致电流的阻断，需要通过离子的运动将它们推开，电流才能恢复。
不同的碱基就像不同大小的木塞，推开它们所需要的力量是不一样的。因此通过电流的波动程度，我们可以推测出该位置对应的碱基，这也就是Nanopore的原理。

Nanopore 不仅仅限于DNA测序，它可以对RNA甚至是蛋白进行检测。
RNA方面：一般的二代测序，由于RNA-seq的读长受限，需要进行重新拼接。而MinION 可以直接对RNA进行测序，之前很多由于拼接而被忽略的可变剪接可以直接被检测到。
蛋白方面：以往蛋白和氨基酸序列的获取主要通过质谱进行，但是质谱仪器价格昂贵，需要搭配相应的液相/气相色谱，而且丝毫没有便携性可言。在马达蛋白的帮助下，蛋白链也可以通过跨膜蛋白，引起电位的变化，从而获取蛋白的序列：



这里介绍的MinION 只是便携版本的纳米孔测序仪，实际上为了不同的需求，ONT也推出了多款搭载多张测序芯片的测序仪：



总结一下Nanopore的优缺点：

• 超高的便携性，MinION可以做到即插即用，非常适合流行病疫区的即时检测
  
• 超长的读长，MinION可以达到 150kb，可用来填补之前测序的gap
  
• 广泛的应用，可以直接对RNA和蛋白进行测序
  
• 低准确度，尤其是2D reads，虽然可以通过降低DNA通过速度或一致性检测提高准确度，但仍无法和二代测序相比
  

参考：
Nivala J, Marks DB, Akeson M. Unfoldase-mediated protein translocation  through an α-hemolysin nanopore. Nat Biotechnol. 2013;31:247–50.
Oxford Nanopore Technologies
Eisenstein M . An ace in the hole for DNA sequencing[J]. Nature, 2017, 550(7675):285.
Jain M ,  Olsen H E ,  Paten B , et al. The Oxford Nanopore MinION:  delivery of nanopore sequencing to the genomics community[J]. Genome  Biology, 2016, 17(1):239. （这篇比较详细，有兴趣可以读一下）

原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/59033852