分享一下跑了四年wb的小心得（经验贴）

生物科研实验室

WB包括：样品的制备，聚丙烯酰胺凝胶的配制（预制胶除外），跑电泳，转膜封闭，孵育一抗，洗膜，敷二抗，洗膜，曝光。
现在跑电泳基本可以做到背景很干净，条带也很清晰～也很少做重复实验了，一批样品就可以跑出干净的条带…
下面是一些重点关注的问题：‼️其实主要就是两点：信噪比，也就是信号强，噪音低。（背景，非特异性结合低）        ‼️信号强：➡️1、蛋白样品浓度一定要足够，一般上样20-30ug，不好跑的蛋白可以到50ug，例如磷酸化蛋白。➡️2、保证蛋白质量够的同时，上样量要少，1.0-15孔的板最好不要超过12ul，1.5-15孔的板最好不要超过15ul，我一般只上6～8ul。➡️3、每个孔上样量要一致❗️如果因为调内参导至上样量有差别，那就补齐，用loading给上样少的补到一样体积。（具体操作和说明看之前的笔记，有发过）这篇：关于wb条带宽窄不一如何解决？

➡️4、可以试试先10v跑15min，再开始85v跑上层，130v跑下层。（预制无需考虑这个问题）➡️5、转膜小分子蛋白用0.22的膜，理论上1kd 1min，比理论上再多10min即可，恒压90v或恒流300mA都可以。➡️6、敷一抗：两张膜可以背靠背孵育，如果抗体量大的话敷的很均匀，抗体量小不建议背靠背孵育。
ps ：一抗的选择很重要❗️如果不知道选择什么牌子的一抗就去查CiteAb这个很好用～或者别的查抗体网页，之前我也出过合集以及教如何使用，可以自行搜一下。        ‼️噪音低：➡️1、封闭时间要够，脱脂奶粉1h起步，冬天到了起码1.5h，不要用析出的奶粉，磷酸化蛋白用BSA或者快封封闭，封闭完空洗膜10min再敷一抗！会干净很多。➡️2、洗膜的时候一抗可以洗久一点，非特异性结合很多时候都在一抗结合时期，二抗正常洗，另外，一抗4度过夜孵育比常温孵育效果好，4度孵育最好超过9个小时。➡️3、二抗常温孵育1h即可，冬天1.5h，不好孵育的蛋白可适当延长时间。➡️4、曝光，一定要选择好用的发光液，如果信号很强，建议稀释发光液，用1*TBS稀释就行～太强有时候反而会掩盖趋势。