为什么western blot 的条带有很多非特异性条带？有可能是一抗的原因吗？

虎威将军

最近刚开始跑目的蛋白的条带，结果发现有很多非特异性条带。我的样品是从细胞里提取的蛋白，在冰上裂解30min，离心后取上清液，加了上样buffer后煮沸，置于-20℃保存。
我开始是室温封闭2h，二抗稀释度是1:1000，后面觉得可能是封闭没有封闭好，所以我调整成了5%脱脂奶粉4℃过夜封闭，二抗稀释度也试过1:2000和1:5000，但出来的条带都是这样，而且图片中条带最深的地方也不是我的目的蛋白所在的分子量，请问有知道的老师能帮我看看这可能是什么原因吗？在此谢过各位老师的耐心解答了。





原文地址：https://www.zhihu.com/question/439323257

长长的路

易选生物丨动物模型WB拍照

WB显色时出现糊一大片的常见原因可能包括以下几点：
1：曝光问题：这可能是由于曝光液配制比例错误、曝光液没有均匀滴在膜上、曝光时间过长导致膜上曝光液流失，或者是曝光板没有水平摆放造成的。
2：蛋白问题：这可能是因为细胞提取的蛋白浓度太低或提取蛋白方法有误（特别是如果内参也出现问题的话），或者是转膜时间过短导致蛋白未充分吸附，或者是电泳液或转膜液过期导致效率下降，或者是操作粗暴导致蛋白被刮落。
3：抗体问题：这可能是因为抗体浓度太低、孵育时间过短、抗体过期、孵育时蛋白面朝下导致孵育不完全，或者是孵育盒内抗体容积太少。
4：电泳问题：这可能是因为电泳电压过低导致蛋白泳动速度降低而弥散，或者是转膜时夹心没有夹紧导致部分蛋白弥散转印。
5：过度转移：如果电泳转移的时间过长或电流设置过高，蛋白质可能会过度转移到膜上，导致条带模糊。
6：膜处理问题：条带模糊也可能与膜处理有关，如膜的湿润不均匀、膜与凝胶的接触不良或膜上存在污染物等。
7：抗体非特异性结合：如果检测的抗体不是特异性的，可能会出现非特异性结合导致背景值升高。
8：蛋白质降解：样品中蛋白质降解可能会导致背景值升高。
9：膜过于湿润：膜过于湿润可能会导致背景值升高。



易选生物丨动物模型WB拍照

1：曝光液的比例按1:1配置。曝光液均匀的滴落在膜上，曝光时间不宜过长，曝光板水平摆正。
2：提取的蛋白浓度不宜过低。提取蛋白时应该低温操作。转膜时间大约70分钟左右。电泳液和转膜液要常换。大约2天换一次。转膜的时候动作一定要轻柔。
3：一抗浓度一般为1:4000或者1:5000。四度过夜或者4度2小时敷育。二抗浓度一般为1:4000或者1:5000。常温摇床孵育一小时。抗体要在保质期内使用。蛋白面朝上，抗体量要充足，使抗体完全覆盖住膜。
4：电泳的时候电压不宜过低，浓缩胶一般为80V，分离胶为100-120V。转膜夹一定要夹紧。
5：膜必须完全湿润，且上面没有任何污染物。膜和胶要完全贴合，中间不能有气泡。
6：抗体为特异性抗体。
7：样品低温保存，尽量低温快速的使用，并及时放回冰箱保存。大量样品可放入-80度保存，少量样品放入-20度保存。
8：膜不宜过度湿润。

易选生物是一家专门为新药研发企业提供专业临床前药效、药理、非GLP毒理一站式实验服务的CRO公司，用专业的技术和高效的沟通帮助客户提高新药研发的效率。
上海易选生物科技有限公司（简称：易选生物，esebio） ：易选生物成立于2019年， 拥有一支由海内外知名大学博士研究生的技术性人才梯队，一家专业的生物医药临床前综合研发服务CRO，为全球的医药企业和科研机构提供专业的临床前药效学评价服务。目前，已形成百余种成熟的动物疾病模型，涵盖神经退行性病变、心脑血管、精神疾病、泌尿系统、免疫系统、呼吸系统、消化系统、皮肤、肿瘤、内分泌系统、眼耳鼻喉等研究等领域。

感恩由您

Hello，各位未来的科研大佬们~
你们还整天呆在实验室苦逼的做Western Blot吗？有没有因为封闭不完全导致条带背景不能满足实验要求而捶胸痛哭，或者苦于封闭时间过久而耽误自己“美好”的科研人生。今天就让我们来谈一谈WB中封闭过程，在此之前，先让我们回顾一下Western Blot过程：
蛋白免疫印迹（Western Blot）是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。WB可用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析，该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。


一、WB的封闭过程

当我们辛辛苦苦做完的免疫印迹实验，结果却出现背景过高，信号又太弱的现象，这就很有可能是你的封闭过程没有处理好的原因。在这里就让我们先来了解一下封闭过程，我们在做western blot实验时，会用到固相载体（如NC膜，PVDF膜），在这些固相载体表面有很多孔洞，通过上游的电转过程，凝胶上的蛋白被转移到固相载体上，蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于表面。也就是说蛋白被塞进了表面的孔洞里面，但由于蛋白并不是连续的，它们会存在许多空隙，并且我们用的抗体本质也是蛋白，也会被吸附在孔洞之中，这样就会有许多非特异性吸附，从而干扰正常结果的呈现。
而常见的封闭过程就是利用封闭液中的蛋白让其与固相载体表面的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，从而将结合位点填补和覆盖，避免后期一抗的非特异性结合，我们将这个过程称之为 “封闭”。同样，这两种作用使封闭液中的蛋白能够牢固的结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。从而使结果呈现的更具有说服力，表达意义也更明显。
总的来说，封闭过程是为了避免高背景和非特异性条带的发生，这么一说，大家对封闭过程有了一个大致的了解了吧，是不是觉得很简单，虽然简单但并不意味着封闭就不重要，恰恰相反，他是整个WB承上启下的一环，也是你整个实验成功的关键。
二、常用的封闭液

从上述我们可以看出，封闭过程是Western Blot 至关重要的一部分， 所以正确的封闭液选择可以让抗体更好更准确的和抗原结合，为成功的WB奠定基础。虽然这个步骤操作简单，但是封闭液的选择却是令很多科研人头疼的问题。接下来我带大家了解一下用于WB实验常用的一些封闭液。
1、脱脂奶粉

脱脂奶粉属于最经济的封闭缓冲液了，需要时甚至可以直接从超市购买（实验中途饿了也可以用温水冲一袋，还不会长胖，哈哈），通常使用浓度为 2.5-5% （w/v）。但由于脱脂奶粉是许多种蛋白质的混合物，里面可能存在生物素和碱性磷酸酶，一定程度上可能会导致背景污染，因此不适合生物素—亲和素的检测方法。此外，其中含有一定量的酪蛋白（casein），是一种磷蛋白（phosphoprotein），如果你的目标蛋白是磷蛋白的话，封闭过程不要选择脱脂奶粉作为封闭液，否则会有很多背景信号（background signal）。即使你的目标蛋白不是磷蛋白，因为是蛋白质的混合物，所以也容易产生较高的背景信号。
2、牛血清白蛋白（BSA）

牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，简称BSA）是从牛血清中提纯之后的一种球蛋白，也是实验室除了脱脂奶粉之外最常用的封闭缓冲液。BSA不是磷蛋白而且是单一蛋白，不会出现封闭磷酸化蛋白时出现背景过高的现象，但是提纯过程中有可能含有IgG或其他血清蛋白等污染物，这些蛋白都可以和哺乳动物抗体产生交叉反应，从而增加非特异性背景信号 (non-specific background noise）。
3、血清

血清是许多蛋白质的混合物，同样可以被用来当做封闭剂。首先，血清能像BSA一样封闭一些非特异性的蛋白结合。此外，待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区（Fc）结合，与抗体特异性无关，因为封闭血清中有抗体，因此可以封闭掉实验用一抗及二抗和样本中Fc受体之间结合，进一步降低非特异性结合。通常使用的浓度为 5-10%（w/v）。但像BSA一样，它含有免疫球蛋白和血清蛋白，会和哺乳动物抗体产生交叉反应。
三、Q-BLOCK 一分钟无蛋白封闭缓冲液

通过对不同种类封闭液的一个学习，你是不是对封闭过程有了一个新的理解。但又开始迷茫自己今后的实验该选择什么样的封闭液？确实，如果选择了不适用的封闭液，可能会导致自己辛辛苦苦做的实验结果变得惨不忍睹，不要担心，在这里给大家推荐一款全能性的无蛋白封闭缓冲液，它能够满足你绝大多数封闭需求。“泉品”Q-BLOCK 一分钟无蛋白封闭缓冲液，它是一种高效快速的封闭缓冲液。多用于Western Blot封闭阶段，此外实验条件允许的情况下还可用于Wetern Blot过程中抗体（一抗、二抗）的配置。纯化学配方且不含蛋白质，能有效防止蛋白质交叉反应，短时间内能够有效提高被检测信号的信噪比。



泉品Q-BLOCK一分钟无蛋白封闭液

1、快速高效

传统的WB实验封闭过程，常采用BSA(牛血清白蛋白)、5%的脱脂奶粉、酪蛋白(Casein)等的封闭液，这些封闭液使用时为了充分封闭住固相载体上的抗原位点，一般需要室温孵育1-2h或者4度封闭过夜，延缓了实验进度，并且封闭时间过长会加大实验风险，导致结果的不稳定性。Q-BLOCK一分钟无蛋白封闭缓冲液针对这一点，将封闭时间缩短至一分钟，极大的加快了整个WesternBlot过程，另外，本产品无需稀释，即取即用，极大的节省了操作流程。
2、无蛋白质干扰

采用无蛋白配方，避免抗体与封闭剂的非特异结合，有效降低了背景。同时，本封闭剂无内源的磷酸化蛋白及生物素，对磷酸化特异抗体及生物素的检测也不会产生干扰。
3、性能高

本封闭剂不与蛋白产生非特异性结合，因而只封闭膜而不会屏蔽样品蛋白的抗体识别位点，大大提高了抗体检测灵敏度。提供比传统封闭缓冲液更好的特定信号和更少的背景噪声，有效提高信噪比。
4、节省抗体

此类封闭液可应用于WB后续实验中抗体的配置，并且Q-BLOCK是无蛋白配方，用于抗体配置可有效延长抗体保存时间。能够节省抗体用量，性价比更高。
四、实验说明

1、从图中可知，与其他品牌相比，Q-BLOCK不仅操作时间短，更有效提高信噪比。


2、纯化学配方、不含蛋白质，稀释抗体可延长保存时间，抗体重复使用次数增加，极大的提高了抗体利用率：


这款封闭液是我们“泉品”现在主推的一款产品，品质上肯定对得起你的选择，使用过程中若遇到相关技术问题可随时与我们联系，我们一定竭尽全力为你的实验保驾护航，使用过程没有烦恼。
五、关于泉品

“泉品” 拥有专业化的资深团队，负责产品的研发，生产，质控，以及品牌推广。“泉品”的理念是“有泉·有品”，泉本意指水源，水是万物之源，寓意滋养，创新，朝气蓬勃，充满希望。品，本意为众多，如《易经》里“云行雨施，品物流形”，现本意又为品质。“泉品”以创新和高品质为核心价值理念，通过自身研发团队，以及与国内外专业科研团队强强联合，不断创新，为生命科学和医药研发行业提供高品质产品和服务。
为了追求给客户带来更好的服务和体验，针对生物医药企业和科研用户，我们将秉承“服务至上”的理念，为用户提供“泉品”的样品试用、技术支持、订单执行及配送服务。泉品现有产品包括：澳洲胎牛血清、一分钟无蛋白封闭缓冲液、自动化蛋白免疫杂交印迹仪（western Blot专用）、高性价比移液吸头、不同规格离心管、血清移液管、实验室移动热转印标签打印机、涂布棒、细胞过滤筛、试剂槽、接种环等，其他新增产品敬请期待。
官网网址：https://www.quan-lab.com/

长长的路

Western Blot内参不齐、非特异条带、背景黑、条带泛白...这么多问题，该怎么解决？一文教你跑出完理想WB结果！



但凡涉及生物医学领域研究，通过Western Blot检测蛋白水平是基本操作，其结果直接影响到课题结论和文章质量。然而，做WB实验的小伙伴，特别是新手小白，不可避免会遇到一些奇怪结果（如上图右）。比如已经做了蛋白定量，内参条带还是不齐，内参出现异常双条带，或者曝光背景很黑，条带泛白，marker显示条带等等问题，这些情况该怎么解决？大师兄为大家整理了一份WB问题解决对策，助你跑出完美WB结果。
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下面我们结合图片展示WB结果中的最常见10类问题给出分析及处理对策：
1.背景高（条带整体很黑）
左侧是高背景结果图、右侧是改善条件之后的结果图


原因及处理对策如下：


<hr/>2.信号低或无信号（无条带）
左侧是低信号结果图、右侧是改善条件之后的结果图


原因及处理对策如下：


<hr/>3.非特异条带（有杂带）
左侧是非特异结果图、右侧是改善条件之后的结果图


原因及处理对策如下：


<hr/>4.条带位置错误（条带不在预期分子量位置）


原因：在目标位置上方存在多个条带，说明蛋白形成了多聚体，或存在蛋白修饰。
处理对策：增加蛋白变性时间。


原因：在目标位置下方存在多个条带，说明蛋白降解。
处理对策：收样时加入蛋白酶抑制剂，避免蛋白反复冻融超过三次。
<hr/>5.条带斑点样缺失（条带上有白斑）
左侧是条带斑点样缺失结果图、右侧是改善条件之后的结果图


原因：转膜过程中出现气泡处理对策：转膜时将气泡排除干净。
<hr/>6.条带不完整（条带中间凹陷，两边高）左侧是条带不完整结果图、右侧是改善条件之后的结果图


原因：曝光时发光液在膜上不均匀
处理对策：将条带浸没在发光液中曝光。
<hr/>7.微笑样条带（条带弯曲）
左侧是微笑样条带结果图、右侧是改善条件之后的结果图


原因：电泳过程蛋白迁移太快，过热
处理对策：降低电压并在低温条件电泳。
<hr/>8.条带发白
左侧是条带发白结果图、右侧是改善条件之后的结果图


原因：蛋白上样量过大或HRP过多；处理对策：减少蛋白上样量，或增大二抗稀释比例。
<hr/>9.非特异黑色杂斑
左侧是非特异黑色杂斑结果图、右侧是改善条件之后的结果图


原因及处理对策如下：


<hr/>10.Marker曝光显示黑色条带
蛋白marker也曝光出来黑色条带


原因：抗体与蛋白marker特异性反应处理对策：在marker和相邻样本泳道之间加一个空白孔。
对于更多WB结果中非常见问题处理，我们给大家准备了一份整理好的WB实验结果中可能遇到的101种问题及其处理对策PDF文件，需要的小伙伴可以关注BioAdvance，回复WB，免费获取~
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卡卡

• PVDF膜一定要用100%的甲醇完全活化
  
• 使用前镊子、膜必须保证是干净的，没有沾染污染物
  
• 适当延长封闭时间：5%脱脂奶粉封闭2h以上
  
• 可以适当的增加洗膜液中吐温的浓度
  
• 磷酸化蛋白建议用BSA封闭
  
• 抗体浓度过高（一抗浓度或者是二抗浓度)，适当降低抗体的浓度
  
• 抗体稀释液和封闭试剂出现交叉反应，可以换一种封闭液试试
  
• 曝光时间过长，控制好曝光时间，加显影液之后，马上去拍照（适合冷CCD成像法）
  

清风寡欲

看得出来你是刚开始做WB实验，因为你的问题描述里缺失了做WB最重要的几个要点的描述。

• 蛋白上样量。这一点很重要。过多的蛋白上样会造成非特异性结合，使最终的WB结果看上去很脏。而你的问题描述里并没有蛋白定量的步骤，也没有具体的蛋白上样量。你不会没定量就跑胶了吧？一般10ug蛋白就足够做WB了。
  
• 一抗的信息。既然是WB的troubleshooting，怎么能不给出一抗的信息呢？什么抗体，哪家公司的，针对的人源还是鼠源，自己是单抗还是多抗，这些都很重要。查看抗体的产品信息页可以得到很多有用的信息，比如WB使用时的dilution。如果一个抗体真的差成你图里的样子，应该没法上市吧。
  
• 二抗的迷之使用。你的二抗看上去应该是HRP标记的。这种二抗灵敏度极高，可以检测到pg级的抗原。所以使用的时候，一般是1:10,000稀释的。你用1:5,000的dilution也嫌太高了。
  
• 迷之封闭。5%脱脂牛奶封闭是常规操作，室温一小时足以。第一次听说封闭过夜的。你溶解牛奶用的是PBST还是TBST（特别注意一下，有没有加Tween20）？你需要用同一种buffer在抗体孵育完成后清洗膜。另外，你的一抗、二抗有没有稀释在牛奶里？一抗最好孵育过夜，二抗不能太长，一般室温45分钟到一小时。
  

其他暂时不说了，你先对照以上几条看看。排除了这些可能性还有问题再说。以上。