原位杂交（In situ hybridization, ISH）四部曲之-理论知识与应用介绍(1)

乔帮主

1 背景知识介绍
原位杂交(In situ hybridization, ISH)已成为一种常用的实验室技术，用于分析基因表达和细胞中特定DNA和RNA分子的定位，已发展成为基础科学研究和临床诊断的重要工具。ISH的目标之一是原位定位基因序列，并在保持细胞完整性的同时可视化细胞内的产物。这允许对异质组织内的局部产物进行有意义的解剖和组织学解释。由于ISH检测可能出现假阳性和假阴性结果，熟悉所分析分子的病理生理学和所涉及的细胞过程以及检测的局限性可以帮助避免临床标本的错误诊断 [1]。ISH主要步骤包括：合成核酸探针、标记、纯化和特异性靶标退火（基本工作流程与印迹杂交近似），目前主要有两种办法来实现可视化显示原位RNA和DNA靶标，即，即荧光原位杂交 (Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) ，显色原位杂交 (Chromogenic in situ hybridization, CISH) 检测和银染原位杂交（Silver-enhanced in situ hybridization ，SISH）。



（图1原位杂交技术的基本步骤）

荧光原位杂交 （FISH） 是一种分子细胞遗传学技术，可在细胞水平的遗传识别提供可靠的成像生物标志物。在FISH图像中识细胞的一个重要先决条件是准确分割细胞，以量化每个细胞内的DNA/RNA信号 [2]。



（图2 人类染色体进行荧光原位杂交（FISH）鉴定。特定染色体区域特异性的 DNA 探针附着在荧光标记物上并与染色体扩散杂交。图为计算机生成的“伪彩色”图像，其中探针之间荧光波长的微小变化被增强为不同的原色。与特定染色体杂交的探针组合为每条染色体产生独特的模式。这使得检测染色体之间的节段缺失

显色原位杂交(CISH) 是一种相对较新的方法，使用基于过氧化物酶的显色反应测定基因扩增，可以使用传统的明场显微镜观察。与 FISH 一样，CISH 决定了基因扩增的实际程度。然而，与FISH不同的是，可以使用标准实验室设备识别阳性信号。可以同时评估标本的组织病理学，信号不会衰减，而是在很长一段时间内保持稳定，允许载玻片在室温下储存。因此，与FISH相比，CISH具有更广泛的整合到诊断实验室的潜力[3]。



（图3 显色原位杂交（CISH）实验结果，黄色/棕色/棕黄色/褐色为阳性信号[6-7]）

银染原位杂交（SISH）是一种流行的原位杂交变体采用金相检测技术,杂交探针联接酶，可诱发中和反应并可使溶液中金属银沉淀到探针靶位点上,从而达到信号检测的效果。尽管产生的色斑仅一种颜色—黑色（氧化后），非常稳定，能够保存很长时间，此外颜色较深、有细密纹理，便于观察和信息采集[4-5]。



（图4  银原位杂交（SICH）实验结果，黑色斑点为阳性信号[8]）

2 掌握原位杂交的优势
（1）原位杂交(ISH)已成为一种常用的实验室技术，用于分析基因表达和细胞中特定DNA和RNA分子的定位。
（2）这些技术已发展成为基础科学研究和临床诊断的重要工具。
（3）由于ISH检测可能出现假阳性和假阴性结果，熟悉所分析分子的病理生理学和所涉及的细胞过程以及检测的局限性可以帮助避免临床标本的错误诊断。
3 原位杂交基本原理
3.1 原位杂交方法
ISH依赖于标记的核酸探针对固定细胞或组织中的互补序列的特定退火，并通过显色，荧光或电子显微镜方法观察杂交探针来检测。各种方案中的关键变量包括杂交温度、盐浓度、pH值、使用的探针类型、目标分子以及杂交和洗涤溶液。探针与杂交靶的熔融温度(temperature, Tm)为50%双链核酸链分离的温度，许多杂化反应的最佳温度通常是低于/介于Tm 15 ~ 25℃。当使用的探针由研究者制作时，测定Tm更为重要，而当使用预先建立的方案时，测定Tm对于商业购买的探针或杂交试剂盒则不那么重要。
3.2 探针类型
许多不同类型的探针用于ISH，包括合成寡核苷酸探针，互补DNA (complementary DNA, cDNA)和互补RNA (complementary DNA, cRNA)探针。通常用于福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)组织的探针大小范围为20到500bp。然而，成功的ISH已经实现了更小的和更大的探测器。寡核苷酸探针的大小范围从20到50个碱基。这些单链DNA分子很容易用自动DNA合成器生成，cRNA探针或核糖探针在技术上更难制造，因为它通常需要从合适的质粒中转录克隆的DNA。cRNA探针的好处是它们非常敏感，可以标记高特异性检测共轭（conjugates）增加了检测感兴趣的目标的灵敏度，特别是当目标丰度较低时。cRNA探针的一个缺点是在短时间储存后不稳定和降解。
3.3 标签和信号检测
历史上放射性标记探针用于ISH，目前，特别是在临床实验室中使用ISH时，经常使用地高辛（digoxigenin）或生物素（biotin）标记的非放射性探针。生物素化探针可以用亲和素（avidin）/链霉亲和素与碱性磷酸酶结合（streptavidin conjugated to alkaline phosphatase）/辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）进行光镜明场检查。荧光标记探针可用于荧光显微镜，胶体金标记探针可用于透射电子显微镜的超微结构ISH。地高辛（Digoxigenin）标记的探针比生物素化探针具有更高的灵敏度和更低的背景染色。
3.4 组织准备
理想的ISH固定应同时保持组织形态和核酸完整。尽管FFPE会导致核酸交联增加，反应性降低，但与形态学保存不理想的新鲜冷冻组织相比，FFPE优良的形态学细节可以抵消敏感性的损失。多聚甲醛固（Paraformaldehyde, PFA）定通常优于缓冲福尔马林核酸保存，因为多聚甲醛通常是比缓冲福尔马林更好的固定剂。
3.5 对照ISH
组织反应的特异性控制对于正确解释ISH信号至关重要，在制定特定的ISH测定法时应采用不同的对照，有利于获得正确的阳性信号。检测核酸保存的阳性对照可以包括大多数哺乳动物细胞表达的分子，如肌动蛋白（actin）；阴性对照可能包括在ISH反应中省略特定探针或使用应导致组织中没有信号的特殊探针。用RNAse(用于RNA靶标)或DNAse(用于DNA靶标)对组织进行预处理也应该导致在测定结束时ISH信号的消除。
4 ISH的应用
4.1疾病中ISH的应用
特异性感染因子的检测是ISH在临床实验室中最广泛使用的一种。这些包括在诸如子宫颈（uterine cervix）和扁桃体（扁桃体）等组织中检测人类乳头瘤病毒的特定亚型。鼻咽肿瘤和部分淋巴瘤中的eb病毒（Epstein-Barr virus）。检测其他病毒感染包括巨细胞病毒、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱疹病毒等皮肤病变。肺感染中的腺病毒, 脑活组织检查发现JC病毒。以及特异性核糖体RNA探针已被用于FFPE组织中特异性真菌生物的诊断。



（图5 ISH在感染疾病检测中大有作为）

4.2 ISH检测基因表达
ISH方法是检测正常和病理组织中基因表达和研究基因调控的有力工具。与其他分子方法相比，ISH的一个显著优势是能够在细胞水平以及异质组织的细胞内定位mRNA，因为组织完整性得以保存。例如癌症在细胞水平上是众所周知的异质性，区分表达目标细胞类型的能力有助于支持病理学家的组织病理学解释。其中一个例子是浆细胞病变的克隆性测试（clonality in plasma cell lesions）。虽然免疫组织化学可以用抗免疫球蛋白轻链的抗体来完成，但间质中免疫球蛋白的水平通常很高，因此免疫组织化学分析通常有重背景染色。由于RNA大多在细胞内，免疫球蛋白的ISH检测通常没有明显的背景问题。此外，当肿瘤分化较差时，通常的免疫组织化学方法可能无法检测到蛋白质产物。白蛋白ISH在诊断此类肿瘤方面具有一定优势。



（图6 ISH在肝癌的检测应用）

4.3 ISH检测非编码RNA
近年来的研究表明，人类基因组中存在许多非编码RNAs (noncoding RNAs,ncRNAs)，研究最多的两种ncRNAs包小RNA (miRNAs)和长链非编码RNA (long noncoding RNAS, LncRNAs)。mir - rna的长度通常为22个核苷酸，而lncRNAS的长度大于200个核苷酸。非编码RNA作为肿瘤抑制基因和致癌基因具有重要作用，在肿瘤发生中起着重要作用。它们通常以与蛋白质编码基因相同的方式在细胞核中被RNA聚合酶II转录。然后它们在细胞质中被加工，在那里它们有大部分的功能，它们也介导转录后基因沉默。最近的研究表明，人类基因组中可能有超过6万个lncrna，这使得它们的数量是已知蛋白质合成基因的两倍多[9-10]。LncRNA和miRNA一样，没有相应的蛋白质。ISH在致癌和抑瘤LncRNA中的应用包括乳腺癌、前列腺癌和甲状腺癌的研究。



（图7 ISH检测疾病中的非编码RNA）

5 提高阳性检测的措施
（1）多探针检测低丰度靶标：组织中低丰度靶标的存在可能导致假阴性结果。提高检测灵敏度的方法，如使用非常敏感的检测技术，包括RNA探针或多个寡核苷酸探针混合法（cocktail），应该有助于解决这个问题。
（2）合适的组织/细胞处理：ISH试验的假阴性结果可能是由于组织过度固定导致过度交联和在ISH过程中处理不理想，FFPE标本的理想固定时间为4 ~ 24 h。在杂交反应开始前，蛋白酶的酶消化可以部分地逆转过度固定。载玻片暴露于高温或蒸汽缓冲盐溶液中，也有助于提高检测特定目标低拷贝数的能力。
（3）针对靶标或样品提前制定方案：杂交前组织的过渗透性可能是假阴性结果的另一个原因。应在实验室中针对固定类型和固定时间制定专门的方案。
（4）严谨的操作和实验环境：假阴性结果的另一个原因可能包括在测定过程中DNA质量低或RNA降解。核糖核酸酶在手和头发上非常丰富，因此使用手套和适当的实验室服装将有助于减少这些问题。在没有rnase的环境中工作是必要的。
6 ISH优势
ISH已成为诊断病理实验室的一种有用的诊断工具，作为活组织检查或切除组织工作的一部分，在病理实验室常规进行HPV和EBV组织检测。其他病毒的组织分析也提供了一些优势，特别是当使用免疫组织化学抗体进行高背景染色时。在免疫组织化学反应(如白蛋白和免疫球蛋白)中，高水平的血清蛋白具有高背景染色，ISH也比免疫组织化学有一些优势。当细胞内核酸的数量可能比翻译的蛋白质更丰富时，由于细胞内蛋白质储存或特定蛋白质的快速分泌，ISH也提供了一些优势。对于ncRNA的形态分析，ISH提供了一种直接的方法来可视化这些基因产物在细胞和组织中的定位，因为没有可用的蛋白质用于免疫组织化学分析。
7 结束
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参考：
[1] Chu YH, Hardin H, Zhang R, Guo Z, Lloyd RV. In situ hybridization: Introduction to techniques, applications and pitfalls in the performance and interpretation of assays. Semin Diagn Pathol. 2019 Sep;36(5):336-341. doi: 10.1053/j.semdp.2019.06.004. Epub 2019 Jun 12. PMID: 31227426.
[2] Bayani J, Squire JA. Fluorescence in situ Hybridization (FISH). Curr Protoc Cell Biol. 2004 Sep;Chapter 22:Unit 22.4. doi: 10.1002/0471143030.cb2204s23. PMID: 18228455.
[3] Hanna WM, Kwok K. Chromogenic in-situ hybridization: a viable alternative to fluorescence in-situ hybridization in the HER2 testing algorithm. Mod Pathol. 2006 Apr;19(4):481-7. doi: 10.1038/modpathol.3800555. PMID: 16444193.
[4] Papouchado BG, Myles J, Lloyd RV, Stoler M, Oliveira AM, Downs-Kelly E, Morey A, Bilous M, Nagle R, Prescott N, Wang L, Dragovich L, McElhinny A, Garcia CF, Ranger-Moore J, Free H, Powell W, Loftus M, Pettay J, Gaire F, Roberts C, Dietel M, Roche P, Grogan T, Tubbs R. Silver in situ hybridization (SISH) for determination of HER2 gene status in breast carcinoma: comparison with FISH and assessment of interobserver reproducibility. Am J Surg Pathol. 2010 Jun;34(6):767-76. doi: 10.1097/PAS.0b013e3181d96231. PMID: 20421783.
[5] https://www.cytotest.com/cn/cish.asp
[6] Monzo M, Navarro A, Bandres E, Artells R, Moreno I, Gel B, Ibeas R, Moreno J, Martinez F, Diaz T, Martinez A, Balagué O, Garcia-Foncillas J. Overlapping expression of microRNAs in human embryonic colon and colorectal cancer. Cell Res. 2008 Aug;18(8):823-33. doi: 10.1038/cr.2008.81. PMID: 18607389.
[7] https://www.uptbio.com/news/view/758.html
[8] Wang T, Amemiya Y, Henry P, Seth A, Hanna W, Hsieh ET. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Can Clarify HER2 Status in Gastric Cancers with "Polysomy 17". J Cancer. 2015 Feb 26;6(5):403-8. doi: 10.7150/jca.11424. PMID: 25874002; PMCID: PMC4392047.
[9] Prensner JR, Chinnaiyan AM. The emergence of lncRNAs in cancer biology. Cancer Discov. 2011 Oct;1(5):391-407. doi: 10.1158/2159-8290.CD-11-0209. PMID: 22096659; PMCID: PMC3215093.
[10] Evans JR, Feng FY, Chinnaiyan AM. The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer. J Clin Invest. 2016 Aug 1;126(8):2775-82. doi: 10.1172/JCI84421. Epub 2016 Aug 1. PMID: 27479746; PMCID: PMC4966302.

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