胶体金免疫层析法快速检测牛奶、奶粉、饲料中的三聚氰胺

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引 言
三聚氰胺(Melamine，图1a)，化学名为2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪，是一种重要的氮杂环有机化工原料，主要用作生产三聚氰胺甲醛树脂的原料，这种树脂被广泛运用于木材、塑料、造纸、纺织、皮革等行业;三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等［1］。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素，而常规的“凯氏定氮法”检测食品或饲料中蛋白质含量时不能排除这类“伪蛋白氮”的干扰，因而一些不法分子为降低成本，在牛奶、奶粉和饲料添加这种非食品性化工原料，以提高其产品中的蛋白质含量。2008年10月，我国制定了乳品中三聚氰胺管理限量值，婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg/kg;含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值为2．5mg/kg。目前，检测三聚氰胺的主要方法有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)，这些方法虽然准确度高，但样品预处理复杂、设备昂贵，检测费用高。近年来，酶联免疫吸附法］以及胶体免疫层析试剂条等已用于三聚氰胺的检测，但仍存在灵敏度不够高或特异性不够强等不足。本研究对三聚氰胺的分子结构进行了较合理的修饰，合成了两种三聚氰胺衍生物，并分别与牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白相连制得免疫原和包被抗原。利用杂交瘤抗体制备技术得到抗三聚氰胺的单克隆抗体，以所制得的抗体为基础，建立了测定牛奶、奶粉、饲料中三聚氰胺的胶体金免疫层析法。
2 实验部分
2． 1 仪器与试剂
UV-2300型紫外-可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司);Dura12FV纯水机(美国THELAB公司);SunriseRemote酶标仪和M12/2R洗板机(奥地利Tecan公司);硝酸纤维素膜(Whatman公司)，底板，吸水纸，玻璃纤维素膜(上海杰一生物有限公司);三聚氰胺(成都长征化学试剂有限公司);柠檬酸三钠，氯金酸，二甲亚砜(上海国药有限公司);牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)、鸡卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)、酪蛋白、3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(3，3，'5，5，'-tetramethylbenzidine，TMB)、二环己基碳二亚胺(N，N-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuc-ci-nimide，NHS)和二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF)均购自美国Sigma公司;羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司);2-氯-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪(2-Chloro-4，6-diamino-1，3，5-triazine，CAAT，比利时AcrosOrganics公司);三聚氰酸、三聚氰氯(上海国药有限公司);环丙氨嗪(浙江国邦医药有限公司);阿特拉津(浙江中山化工有限公司)。其余试剂均为分析纯。
2． 2 实验方法
2．2．1三聚氰胺衍生物的制备本研究对三聚氰胺的分子结构进行了较合理的修饰，制备了两种三聚氰胺衍生物。衍生物1(分子结构如图1b):称取CAAT加入反应瓶，用无水甲醇溶解，再加入对氨基苯甲酸(溶于KOH-无水甲醇中);反应回流5～12h，直到CAAT反应完全;反应混合物过滤，并用无水乙醇和蒸馏水各洗3次，得到白色粗产物;再用甲醇-二氯甲烷过柱，得到纯品。衍生物2(分子结构如图1c所示)的制备过程与制备衍生物1相同，但溶剂为无水乙醇，衍生试剂为3-巯基丙酸。


2．2．2免疫原和包被抗原的制备分别称取衍生物1(或衍生物2)和DCC、NHS，共溶于DMF中，室温下搅拌过夜，将混合液离心5～20min，取上层清液，缓慢加入到0．01%～0．02%的BSA(或OVA)中，搅拌1～10h，离心分离，取上层清液，透析4～5d，溶液冷冻干燥，置冰箱中存放，其中，衍生物1-BSA为免疫原，衍生物2-OVA为包被抗原。
2．2．3单克隆抗体的制备抗三聚氰胺的单克隆抗体由杂交瘤技术制备［15］。经免疫原免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合，细胞培养、筛选等过程，筛选出能分泌抗三聚氰胺抗体的杂交瘤细胞，再将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔产生腹水，用硫酸铵沉淀法纯化腹水中的单克隆抗体，纯化抗体与等体积甘油11混合，并置于"20保存。
2．2．4胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金［16］:称取1g氯金酸，溶于100mL水中，配成1%氯金酸溶液。取1mL1%氯金酸溶液，加入装有100mL沸腾的超纯水的圆底烧杯中。继续加热搅拌，快速加入2．5mL1%柠檬酸三钠溶液。当溶液的颜色变为透明的酒红色时，加热5min后，停止加热。冷却至室温，用补充至原体积。4贮存备用。
2．2．5胶体金标记单克隆抗体取100mL胶体金溶液，用0．1mol/LK2CO3溶液调节胶体金溶液至pH7．0～9．0，缓慢加入400μL饱和硫酸铵纯化的1．45mg/mL单克隆抗体，继续搅拌30min。在4中静置2h后，边搅拌边逐滴加入BSA封闭剂，持续搅拌10min后，4放置过夜。金标抗体溶液常温低速离心，弃去沉淀。取红色上清溶液于低温高速(14000r/min)离心40min。取管底可流动的暗红色沉淀，用PB溶液(0．02mol/L磷酸盐缓冲液，pH7．4，含一定浓度的蔗糖，BSA和吐温-20)将沉淀混悬为原体积的1/10，4保存备用。

2．2．6胶体金免疫层析试剂条的组装、检测及结果判定在2．5cm×0．5cm的玻璃纤维素膜上喷涂用PB溶液稀释的30μL金标抗体，37干燥2h，即为胶金垫。将包被抗原(1g/L)和羊抗鼠IgG(稀释比为150)在硝酸纤维素膜(NC)上点样，分别作为检测线(T)和质控线(C)，室温干燥。取出一块底板，将喷有T线和C线的硝酸纤维素膜粘贴在中央区，分别将吸水纸和胶金垫粘贴于硝酸纤维素膜的上方和下方。两者之间重叠约2mm，再在胶金垫的下方粘贴喷有缓冲溶液的玻璃纤维素膜作为样品垫，组装成胶体金免疫层析试剂条，如图2a所示。100μL三聚氰胺标准溶液(或样品试液)于样品垫中，溶液将沿吸水纸方向移动。首先与胶金垫上的金标抗体结合，并一同继续向吸水纸方向移动，到达T线区域。在T线处，溶液中的三聚氰胺与包被抗原竞争金标抗体，溶液中的三聚氰胺浓度越大，能够与包被抗原相结合的金标抗体的量越少，胶体金的颜色(红色)越浅，通过比对颜色的深浅从而判断三聚氰胺的含量。当金标抗体到C线区域，将与羊抗鼠IgG结合，故在C线处总会出现胶体金的颜色(红色)。整个检测过程仅需10min就可完成。胶体金免疫层析法的结果判定(图2b):当检测线和质控线均出现红色条带，判定为阴性;当检测线无红色条带，质控线出现红色条带，判定为阳性;当检测线和质控线均未出现红色条带或只有T线有红色条带，试剂条无效。


2．2．7样品采集、预处理及检测从当地市场上购得牛奶(样1、样2)，奶粉和饲料(鸡、猪)3种样品，经简单的样品处理后用所制备的免疫层析条检测。样品处理:(1)牛奶:取1mL牛奶，加入1mL样品稀释液(0．02mol/LPBS，含0．5%吐温-20，pH7．4)稀释。(2)奶粉:取1g奶粉，倒入50mL离心管中，加入10mL去离子水，涡旋2min，取1mL混合的牛奶样品至5mL离心管中，用1mL的样品稀释液稀释。(3)饲料:碾磨均匀，取1g至5mL离心管中，加入2mL甲醇-水(23，V/V)，涡旋2min，7500g离心5min，取上清液100μL至1mL离心管中，加入300μL样品稀释液。取 100 μL样品试液于样品垫中，10 min后观察 T线和 C 线中颜色( 红色) 的深浅作判定。
3 结果与讨论
3． 1 三聚氰胺衍生物的制备

在衍生物1(图1b)中，三聚氰胺原有分子结构保留较完整，且连接桥为苯基，这种修饰方式将使所制备的免疫原具有更强的免疫原性，且产生的抗体特异性将得到提高。在衍生物2(图1c)中，1位上的N被S所取代，且连接桥为直链，将使抗体与包被抗原的结合力减弱，从而提高检测的灵敏度。
3． 2 胶体金纳米颗粒的表征
胶体金纳米颗粒的粒径大小与胶体金探针稳定性密切相关。用紫外-可见分光光度计可以测出胶体金纳米颗粒的最大吸收波长。从图3a可见，合成的不同批次的胶体金其最大吸引波长几乎没有变化，即λmax均为520nm。从透射电子显微镜(TEM)照片(图3b)可见，胶体金的平均粒径为18nm，符合胶体金免疫层析法中胶体金颗粒粒径大小的要求。
3． 3 免疫层析试剂条检测三聚氰胺的检出限
配制浓度为0，0．1，1，10，100和1000μg/L三聚氰胺标准溶液。取100μL标准溶液于样品垫中，10min后观察结果(图4)。随着三聚氰胺的浓度升高，在C线区胶体金颜色(红色)强度较大，并且无明显变化，但在T线区胶体金颜色(红色)强度逐渐降低，在1μg/L时T线颜色明显变浅，而在10μg/L时T线颜色基本消失。若将T线颜色基本(或完全)消失所对应的浓度定义为胶体金免疫层析法的检出限，则可判定本研究所制备的三聚氰胺试纸条的检出限为10μg/L，远低于国家所制订的三聚氰胺的限量值，也低于文献［14，15］报道的检出限，表明制备的三聚氰胺试纸条灵敏度高。
3．4免疫层析试剂条检测三聚氰胺的特异性

选取了10种物质(CAAT、三聚氰氯、三聚氰酸、环丙氨嗪、阿特拉津、盐酸克伦特罗、氯霉素、吡虫啉、林可霉素和左旋-18-甲基炔诺酮)进行特异性实验，前5种物质均含有三嗪类物质的分子骨架，为三聚氰胺的类似物。将这10种物质均配成浓度为1000μg/L的溶液，并取100μL溶液于样品垫中，10min后观察结果(图5)。从图5a可见，1000μg/LCAAT和环丙氨嗪可使T线颜色基本(或完全)消失，即与10μg/L三聚氰胺所产生的C线颜色变浅(甚至消失)的效果相当，因此CAAT和环丙氨嗪与三聚氰胺试纸条的交叉反应率(CR)约为1%。从图5还可见，1．0μg/L其它8种物质用三聚氰胺试纸条检测，T线颜色与C线颜色基本相近，表明其它8种物质与三聚氰胺试纸条均无交叉反应，说明制备的三聚氰胺试纸条不仅灵敏度高，而且特异性强。
3． 5 加标样品的检测

对牛奶样1，牛奶样2、奶粉、鸡饲料和猪饲料进行了加标回收实验。牛奶样品的加标浓度为0．5，2．0和4．0mg/L，奶粉和饲料的加标浓度为0．5，2．0和4．0μg/g。加标样品预处理后，稀释200倍，使样品稀释后的最终浓度为2．5，10和20μg/L。取100μL样品液加入样品中，10min后观察结果。样品稀释液同时用酶联免疫吸附分析法(ELISA)进行检测。表1为两种方法对加标样品的测定结果。从表1可见，试剂条的检测结果与ELISA的检测结果相一致。
3． 6 免疫层析试剂条的稳定性
将所制备的试剂条装入充有氮气和放有干燥剂的小袋中，4密封保存150d，检测0μg/L浓度的三聚氰胺，结果T线的颜色与当天做的试剂条T线的颜色一致，表明试剂条稳定性良好。本研究合成了两种三聚氰胺衍生物，分别用于制备免疫原和包被抗原，并利用杂交瘤抗体制备技术得到抗三聚氰胺的单克隆抗体，建立了灵敏度、特异性强、简单、快速的测定三聚氰胺的胶体金免疫层析法，可用于食品和饲料中三聚氰胺的快速检测。