酶的反应动力学

乔帮主

提醒：本篇文章较长，且对于部分人较为难懂，但文章内核非常优秀，建议学生党、爱好者或相关专业的人深入阅读。
作者：极地冰川
一.常见的化学动力学方程

在讨论酶的反应动力学之前，我先带领大家先复习一下化学反应动力学的几种常见情况。
1. 一级反应

一级反应是指反应速度只与反应物浓度的一次方成正比的反应。


即下图所示：


因此，该化学反应的反应动力学方程可表示为：



由一级反应的定义可得：


因此可得：


移项得：


解得：


2. 二级反应

在二级反应中，反应速率与反应物浓度的二次方成正比，比较典型的形式为


对于反应：


经分析，对于反应过程中任意一刻，有：


动力学方程为：


联立可得：


解得：


对于反应：


则有两种情况。当反应物A和反应物B初始浓度相同时，则推导方法与上述过程基本类似，可得其数学表达式为：


当反应物A和B的起始浓度不同时，可得：


所以：


当反应级数为大于等于3的整数时，其动力学方程的推导过程整体与简单的二级反应的推导过程类似。
3. 零级反应

零级反应的特征为反应速率与反应物浓度无关（即零次幂相关），为常数。零级反应较少，一些发生在固体表面上的反应属于零级反应。如氨在钨、铁等催化剂表面上的分解反应。


这是由于当反应物分子吸附于固体催化剂表面进行反应且浓度足够大，催化剂表面被反应物分子完全覆盖时，其反应速率只与催化剂的表面积有关而与反应物分子本身浓度无关。
动力学方程可写为：


复习完了基础的化学动力学方程，那就言归正传，回到酶促反应动力学的主题上。
二.中间络合物学说的提出与米氏方程的导出

长久以来，人们在社会生产实践中逐渐认识到化学反应的速率随着反应物浓度的提升而加快。1903年，巴黎索邦大学的Victor Henri在用蔗糖酶水解蔗糖的实验中，在固定了蔗糖酶浓度，改变蔗糖浓度对酶的影响时，观察到二者的关系呈现矩形双曲线型，即我们在高中课本上见到的那张经典的图示：


由图像可知：在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增加而急骤加快，两者呈正比关系，表现为一级反应。随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。此时即出现了酶的底物饱和现象。所有酶都有饱和现象，只是饱和时所需的底物浓度不同而已。
借由实验结果，Henri做出了一个假设，他认为在酶催化底物转变为产物的过程中，会产生一个由酶和底物分子结合形成的不稳定的中间产物。这个中间产物不仅容易生成，而且容易分解出产物，释放出原来的酶。此即著名的中间络合物假说。同时Henri针对蔗糖酶的转化反应提出了一个初步的公式：


其中K、Φ、m、n均为常数，v为反应速率，[S]为底物浓度，[P]为产物浓度
以现在的观点来看，该方程表明酶促反应受到底物的抑制，为典型的有抑制剂下的酶促反应。
1913年，Michaelis L.和Menten M.重新考察了Henri的研究结果，在中间络合物假说的基础上考虑快速平衡过程并重新推到了其数学表达式并将有关结果发表在与《Biochemische Zeitschrift》（《生物化学杂志》，即《FEBS  Journal》的前身）。


二人根据中间络合物假说提出了单底物酶促反应的快速平衡模型，其反应过程可表示如下：


其中E表示游离状态下的酶，而S为反应底物，ES为不稳定的中间产物，P为产物。


Michaelis（左）和Menten（右）
二人在此基础上，提出了单底物不可逆酶促反应的动力学方程，即著名的Michaelis-Menten方程（米氏方程）。


其中V0为酶促反应的初速度，Vmax为酶促反应的最大速度，[S]为底物浓度，而Ks为解离常数，即K2/K1
米氏方程的推导建立在三个基本假设上：
（1）在反应开始初期，产物的生成量极少，逆反应可不予考虑；
（2）底物浓度远远大于游离酶的浓度，因此在反应过程中底物浓度基本上保持恒定；
（3）反应的第二步为反应的限速步骤，即K2 ≫ K3，以保证 ES 分解为 P 的速率不足以破坏 E 和 ES 之间的平衡。
其推导过程如下：
假定 E + S → ES 可迅速建立平衡，且反应的第二步相比第一步要慢得多，因此，该反应的整体反应速率由第二步决定，即：


由于[ES]不稳定且浓度小的特性，在实验上不易测量，因此可通过其他易测量的参数来表示。因此，利用第一步快速平衡中的ES解离为E和S的反应常数：


则有：


由于在反应过程中酶的总量处于恒定，由此写出酶守恒公式：


因此：


将上式代入至


中，得：


整理得：


将


代入上式，得：


因为反应过程中的最大速率即为当所有的酶均与底物结合参与反应时的反应速率，因此有


代入得：


尽管该模型在解释酶促反应的动力学机理上取得了重大的突破，但其假设仍有不完美之处。尤其是没有理由认为所有酶促反应中均有K2 ≫ K3以及不考虑第二步中存在可逆反应的可能性。因此1925年，Briggs G.E.和Haldane J. B. S. 对米-曼氏模型进行修正，提出了酶促反应的稳态理论。


在稳态理论中，Briggs提出以下假设：
（1）在反应开始的初期，由于产物浓度极低，因此第二步中 E + S → ES 的速率极低，该步骤可忽略不计；
（2）反应起始时，底物浓度远大于酶浓度，底物浓度可近似认为在反应初期保持恒定；
（3）当反应开始后，经过一个极短的时间（几毫秒）后，ES浓度达到一个基本恒定的状态。在一定时间内，尽管S和P的浓度不断变化，但ES的生成速率 vf 和分解速率 vd 基本上相等，ES净生成速率基本保持为0。
数学推导如下：
酶-底物复合物ES的生成速率 vf 可表示为：


ES的分解速率 vd 可表示为：


当进入稳态时，ES的浓度保持恒定，vf = vd，即：


由酶的恒等式


可知：


代入得：


整理得：


令：


则有：


解[ES]得：


代入到


中，得：


从形式上来看，由稳态平衡模型和快速平衡模型推导出的式子具有相同的数学形式，但前者相比于后者有着更高的普遍性。为了纪念Michaelis和Menten两人，人们以上两个式子均称为米氏方程，而Km则被称为米氏常数。
现在我们再回看由Henri做出来的那张图。
通过简单的计算，我们可以发现：


反应速率与底物浓度的一次方成正比，表现为一级反应。


反应速率为常数，表现为零级反应。
而当底物浓度介于这0.01Km和100Km之间时，则反应速率符合米氏方程，为混合级反应。
这与实验结果相符合。
且当[S] = Km时，


我们不难看出米氏常数的物理意义便是当反应速率达到最大反应速度一半时的底物浓度。
三.有关米氏常数

除此之外，米氏常数还可以显示出其他一些物理含义，例如：
（1）作为酶学研究中的重要研究数据，从米氏常数Km的推导中：




我们可以发现，在其表达式中，所有的数据对于在已确定条件的下的某一种酶均为已确定的常数，因此在指定条件下，米氏常数有确定值。米氏常数为酶的特征常数之一，只与酶本身的性质及底物种类有关而与酶的浓度无关，且对于不同的酶，其Km不同。
（2）对于一些专一性不强的酶来说，有几种不同的底物，则就有几个不同的值。而其中最小值对应的底物则是该酶的最适底物。如对于胰凝乳蛋白酶来说，苯甲酰酪氨酰胺就是其最适的底物


至于怎么理解？因为Km对应数值是使酶促反应达到最大速率一半的底物浓度，那么，Km越小，说明底物就更容易使酶饱和，对于底物单位浓度的变化反应速率上升的更快，即 v 对 Δs 更加敏感。
另外，当我们对米氏方程的推导过程中的两种模型进行仔细比对后，同样可以发现一些有意思的事情。
对于这样一个反应：


在快速平衡模型中，平衡常数Ks的表达式为：


而在稳态模型中，米氏常数Km的表达式为：


将二式比对，可以观察到：


当k1 ≫ k2时，即 ES → P + E 为整个反应中极慢的一步，则有：


所以，快速平衡模型实际上是稳态平衡模型的一种特殊情况，即当 ES → P + E 极慢（k2/k1极小）时，稳态平衡基本上等同于快速平衡。从另一个角度看，稳态平衡实质上是在快速平衡的基础上建立一个慢速平衡，即：稳态平衡=快速平衡+慢速平衡。
四.米氏常数的线性化

米氏方程作为酶学上表示酶促反应速率和底物起始浓度之间关系的方程，是描述生物化学中酶促反应动力学的经典方程。然而由于其图线为双曲线型，其图像拟合过程中会产生较大的误差，对于该问题，一个比较便捷的解决方法便是将原有方程变形使其能够以线性形式表达。常用的线性化方法有：Lineweaver-Burk双倒数作图法、Eadie-Hofstee作图法、Hanes-Woolf作图法以及Eisenthal作图法。其中应用最为广泛的为Lineweaver-Burk双倒数作图法。
Lineweaver-Burk双倒数作图法又被称为莱恩威弗-伯克作图，由Hans Lineweaver和Dean burk于1934年提出。其基本形式为将米氏方程等式两边取倒数后变形而成：




该作图方法可以较为直观的得到米氏方程中两个重要参量和。同时也可应用于存在抑制现象的酶促反应过程。但其不足在于实验点过分的集中于直线的左下方，而在低浓度区域的实验点又因倒数后误差较大，往往偏离直线较远，从而影响和的准确测定。此时，可用Eadie-Hoffstee法或者Hanes-Woolf法弥补在底物浓度过小或过大区域Lineweaver-Burk法误差大的缺点。
五.可逆抑制条件下的米氏方程

抑制作用是指抑制剂通过作用于酶的必需基团从而在不使酶变性的基础上降低酶的活性甚至使酶丧失活性。相较于酶的变性，尽管二者的作用效果相似，但从机理上有着本质上的区别。变性过程中，维系酶正常构象的的次级键（氢键、疏水作用、范德华力等，有时也包括二硫键的打开）遭到破坏而失去三维结构从而导致正常生物学活性的丧失；而抑制作用只针对于特定的反应基团，例如，二异苯基磷酰氟可作用于蛋白酶及酯酶活性中心色氨酸的羟基形成磷酯键从而阻碍正常生物学的实现；而有机汞化合物、含卤素的烷化物可作用于巯基等。


在这个过程中，酶分子的空间结构与次级键不受破坏而只有特定的功能基团被修饰而因此酶活的降低。
从抑制剂与酶蛋白中功能基团结合的紧密程度而言，抑制类型可分为不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用。而在可逆的抑制作用中，根据其作用机理，可分为竞争性抑制、非竞争性抑制与反竞争性抑制三种类型。
（1）竞争性抑制

恰如名字所示，竞争性抑制的特征就在于“竞争”二字。这类抑制作用通过抑制剂与底物竞争酶的活性中心，与游离的酶可逆地形成抑制剂-酶复合物，占据酶的反应活性位点从而阻止酶与底物的结合以降低酶的反应速率。


在此种抑制作用中，抑制剂具有与底物类似的结构（例如丙二酸可与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶的反应位点），可被酶错误的识别为底物并结合或者产生空间位阻而阻止底物的正常结合。被抑制剂结合的酶既无法再结合正确的底物，也无法进行正常的酶促反应。实际上降低了酶的有效浓度。在宏观上的表现便是酶的活性受到了抑制。


琥珀酸，又名丁二酸、1，2-乙烷二甲酸，分子式C4H6O4。可在琥珀酸脱氢酶作用下生成延胡索酸。
由于竞争性抑制可认为是对于酶E同时发生了


两个平行反应。因此，根据化学平衡的知识可知，当增大底物S的浓度时，反应


平衡将会右移，而反应


将会受到抑制。因此，可通过增大底物S的浓度来解除抑制剂I的抑制作用。
其动力学方程推导如下：






将


并代入 Ki 的表达式中，得：


由米氏假说得：


代入酶守恒式


得：


代入


得：


变形得：


从数学上分析，竞争性抑制的抑制程度与抑制物 I 的浓度成正比，与底物S的浓度成反比；当[I]和[S]为定值时，Ki越小、Km越大，抑制作用越强。


从Lineweaver-Burk图上我们可以看出，竞争性抑制的一个最典型的动力学特征便是酶促反应的最大速率vmax不变，而米氏常数Km变大。
（2）非竞争性抑制

非竞争性抑制剂可与酶活性中心以外的基团结合，引起酶分子的构象变化使之不能催化底物形成产物。非竞争性的抑制剂既可以与游离酶结合，又可以与底物-酶复合物结合形成 EIS 三元复合物。抑制剂的结合不影响酶与底物的结合，但会阻止酶-底物复合物进一步反应生成产物，因此酶活性降低。一些重金属离子如Cu2+、Pb2+、Hg2+的抑制作用即属于此类





由


得：


同理，由


得：


由


解得：


将以上结果代入到：


整理得：


双倒数方程为：




从非竞争性抑制的米氏方程来看，其抑制程度只取决于抑制剂浓度 [I] 和 Ki有关，而与底物浓度 [S] 与底物的米氏常数Km无关。从图像上可明显看出，在非竞争性抑制中，米氏常数Km保持不变，


（3）反竞争性抑制
与竞争性抑制恰好相反，在反竞争性抑制中，抑制剂只能与酶-底物二元复合物结合，形成的三元复合物无法释放出产物。宏观表现为酶的有效浓度降低，酶活力减少。常见于多底物的酶促反应过程中。


动力学方程为：


双倒数方程为：


其推导过程与竞争性抑制相似，本处不做赘述。


反竞争性抑制的动力学特征为vmax、Km等比例减小，在图像上表现为一组平行的直线。其抑制程度决定于Ki、Km、[S]、[I]。既与[S]成正比，也与[I]成正比；在[I]、[S]一定时，Ki越大，抑制程度越小；Km越大，抑制程度越小。

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