搞定ELISA显色难题，提升实验成功率！

非诚勿扰孟非

　　据统计，超过50%的ELISA实验问题都与显色有关。颜色太浅、颜色太深、没有颜色……这些问题困扰着许多实验人员。如何才能有效解决ELISA实验中的显色问题？本文将为你详细解析ELISA实验中标准曲线和样本的显色技巧。



通蔚ELISA试剂盒

　　标曲和样本都显色，但复孔的CV大


　　ELISA复孔CV值大，除了与移液器和实验者的操作有关外，还可能受到试剂质量、孵育条件、洗涤步骤以及读板仪等多种因素的影响。

1、移液器和操作：移液器的精度和维护保养至关重要。定期校准移液器，并使用正确的操作方法，例如垂直吸液、缓慢释放液体等。实验者自身的操作习惯也会影响结果，建议进行练习以提高加样的精密度和速度，例如在空白板上练习移液，或在多个离心管中加入相同体积的水，用电子天平称量，检验移液的精密度。加快加样速度，减少不同样本之间加样时间的差异也很重要。可以考虑使用多通道移液器提高效率和一致性。

2、试剂：使用高质量的试剂，并按照说明书正确保存和使用。避免试剂过期、反复冻融或暴露于不合适的温度。

3、孵育条件：使用恒温孵育设备，确保孵育温度和时间的准确性和一致性。

4、洗涤步骤：使用洗板机进行洗涤，确保洗涤液的质量和体积一致，并彻底去除未结合的抗体或酶联物。

5、读板仪：定期校准和维护读板仪，确保其工作状态正常。

6、其他操作细节：加样时避免产生气泡，确保试剂充分混匀，避免交叉污染。建议采用反向加样等技巧，减少加样误差。

通蔚温馨提示：如果出现ELISA复孔CV值大，可以从上述几点进行一样排查求证。

　　标曲显色，样本不显色


　　标曲显色但样本不显色的情况，很多时候并非试剂盒本身的问题，而是其他因素导致的。在考虑更换试剂盒或使用高敏ELISA之前，应先仔细排查以下可能性：

1、样本问题：目的蛋白浓度过低：低于试剂盒检测限是常见原因。可以尝试浓缩样本或使用更灵敏的检测方法，例如高敏ELISA或其他蛋白检测技术。

• 样本降解：蛋白酶可能会降解目标蛋白。建议添加蛋白酶抑制剂，并确保样本在合适的温度下保存。
  
• 样本中存在抑制剂：某些物质可能会抑制抗原抗体反应或酶的活性。可以尝试稀释样本或去除抑制剂。
  
• 样本类型不合适：不同的样本类型可能需要不同的预处理方法。确保样本经过必要的预处理，例如稀释、去除杂质等。
  

2、操作问题：

• 试剂配制错误：仔细检查试剂的配制方法和浓度，确保没有错误或混淆。
  
• 孵育时间和温度：严格按照说明书进行孵育，确保时间和温度的准确性。
  
• 洗涤步骤：确保洗涤充分，以去除未结合的抗体或酶联物。
  
• 显色液：检查显色液是否过期或保存不当。
  

通蔚温馨提示：如果上述都没问题，可能是试剂盒的问题。高敏ELISA可以提高检测灵敏度，但并不能解决所有问题。选择合适的ELISA试剂盒和优化实验操作才是获得可靠结果的关键。如果问题仍然存在，建议咨询试剂盒厂商的技术支持。

　　标曲和样本均不显色


　　标曲和样本均不显色的情况，需要系统地排查多个环节。以下是一些可能导致不显色的常见原因：

1、底物问题:底物失效是最常见的原因之一。检查底物是否过期或保存不当。尝试使用新的底物进行测试。

2、终止液:如果ELISA实验需要使用终止液，确保已正确添加且终止液未失效。

3、试剂盒:检查试剂盒是否过期，以及所有试剂是否按照说明书保存。

4、试剂保存:避免试剂反复冻融，并在合适的温度下保存。

5、洗涤:使用正确的洗涤液，并确保洗涤充分。

6、包被抗体(如果适用):如果使用的是用户自己包被的板子，确认抗体有效且包被步骤正确。

7、操作步骤:仔细检查操作步骤，确保试剂添加顺序正确，没有试剂混淆或遗漏。可以使用带有颜色标记的试剂，以便于确认每个步骤是否正确执行。

　8、孵育条件:确认孵育的温度和时间符合试剂盒说明书的要求。虽然振荡可以促进抗原抗体结合，但并非所有ELISA实验都必须振荡。请参考试剂盒说明书。

通蔚温馨提示：如果排除了以上所有可能性，仍然无法解决问题，建议联系试剂盒厂商的技术支持。他们可以提供更专业的帮助，并根据具体情况进行分析。

　　标曲不显色或显色很弱，样本显色


　　标曲不显色或显色很弱，但样本显色的情况，提示可能存在标准品溶解或稀释不充分的问题，但也需要考虑其他可能性。

　　以下是一些可能导致标曲显色弱的常见原因：

1、标准品溶解和稀释:确保标准品完全溶解，并在稀释过程中充分混匀。建议使用涡旋振荡器进行混匀，而不是仅仅依靠移液器吹打。

2、标准品本身的质量:检查标准品是否过期、降解或污染。可以尝试使用新的标准品进行测试。

3、标准品浓度:仔细检查标准品浓度的计算和稀释方法，确保没有错误。

4、试剂配制:检查所有试剂的配制是否正确，浓度是否准确，以及是否有试剂混淆的情况。

5、孵育条件:确保孵育的温度和时间符合试剂盒说明书的要求。

6、洗涤步骤:使用正确的洗涤液，并确保洗涤充分。

7、显色液/底物:检查显色液或底物是否过期或失效。

8、读板仪:确认读板仪已正确校准，并且工作正常。

通蔚温馨提示：如果排除了以上所有可能性，仍然无法解决问题，建议联系试剂盒厂商的技术支持，寻求更专业的帮助。
　　上述为大家整理了ELISA实验中标曲和样本的显色问题，为了避免ELISA实验中出现显色问题，建议实验人员在实验前仔细阅读试剂盒说明书，并严格按照操作步骤进行。同时，定期维护和校准实验设备，选择高质量的试剂，并规范实验操作，可以有效减少显色异常的发生，提高实验的成功率。

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