磁珠法提取核酸的原理及常见问题

病理医师

首先需要明确核酸提取的原则

• 保证核酸的完整性（一级结构）
  
• 适当的浓度以进行下游的实验
  
• 纯度：降低其他物质如蛋白质、脂类的污染，且无有机试剂以及高浓度的金属例子（避免对每单抑制）
  

磁珠法提取核酸主要分为以下4个步骤
裂解-结合-洗涤-洗脱

• 裂解：瓦解组织、破细胞，核酸释放到缓冲液
  
• 结合：缓冲液的核酸与磁珠进行结合（其他杂质也会结合到磁珠上），由于磁珠表面修饰功能基团，例如硅羟基或羧基，这些可以与核酸特异性结合。通过调节结合条件（pH、盐浓度和温度），调节核酸与磁珠的结合力大小。结合力大的时候，核酸与磁珠结合，可以用洗涤液洗去杂质。结合力小的时候，可以将核酸洗脱下来。
  

硅羟基结构图

• 洗涤：将杂质从磁珠上洗涤下来，例如蛋白质、多糖、盐类
  
• 洗脱：将核酸从磁珠上洗脱下来
  

磁珠提取中常遇到的问题：

• 增加磁珠不能提高提取效率：磁珠量过大导致分散较差，而且有杂质，且洗脱下来的核酸较少。具体可以咨询试剂盒的技术人员。
  
• 增加裂解液不一定能提高裂解效果：裂解效果取决于裂解液的成分，以及裂解的混匀程度。
  
• 磁珠不能通用其他用途：每一种磁珠都是特定搭配裂解液和漂洗液的，不能混用。如果要混用可以咨询技术人员。
  
• 避免降解的方法：严格按照说明书投入样本量，已经每个操作步骤充分混匀，避免长时间高温洗脱。
  
• 洗涤的次数不是越多越好：洗涤2-4次，太多会导致核酸损失。
  
• 提取的浓度低：样本加入过多，裂解不完全就进行结合的步骤，至少需要保证裂解到没有肉眼可见的颗粒，洗脱没有进行加热导致洗脱效率低。
  
• 提取的产物纯度低：可能存在蛋白质，可以加入蛋白酶K进行降解；可能存在盐，增加Wash Buffer 2的清洗次数，乙醇残留：增加洗涤后晾干时间。
  

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