CRISPR/Cas检测的破局在何处

2024-12-23 13:30| 编辑: 归去来兮| 查看: 1157| 评论: 0|来源: 分子检测万花筒

摘要: CRISPR/Cas检测技术虽然突飞猛进，但其推广使用目前陷入窘境。

2020年诺贝化学奖由法国生物化学家埃玛纽埃勒·沙尔庞捷（Emmanuelle Charpentier）和美国生物化学家珍妮弗·道德纳（Jennifer A. Doudna）——两位世界顶尖的女性科学家共享，以表彰她们在CRISPR/Cas基因编辑技术所做出的卓越贡献。提到CRISPR/Cas系统，很明显它包含了两个部分：一个是CRISPR阵列，衍生自噬菌体DNA（当涉及细菌CRISPR/Cas系统时）；另一个是与该CRISPR阵列相关的Cas蛋白，即CRISPR-associated protein。截至目前，科学家已发现两大类（Class 1和Class 2），六种Cas型（Cas type I-VI。其中，I、III和IV为Class I；II、V和VI为CIass 2），而有些Cas型中又存在许多的亚型（subtype）。例如，我们目前常用的CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13，分别属于Class 2 II、Class 2 V和Class 2 VI型。这里必须说明一点，目前研究表明CRISPR和Cas不能单独存在，二者需形成复合体，即RNP复合体（Ribonucleoprotein complex）时才能发挥核酸酶活性，用于基因编辑、表观遗传调控和分子检测等。由于CRISPR和Cas在发挥分子检测功能时“比燕齐飞”，因此较之“CRISPR检测”或“Cas检测”表述，“CRISPR/Cas检测”更恰当。

CRISPR/Cas系统能用于分子检测，在于所形成的RNP复合体在识别目标核酸分子时，会激活Cas蛋白的顺式切割（cis cleavage）和反式切割活性（trans cleavage）。因此，无论顺式切割和反式切割，大部分都是目标物存在时被激活，继而实现对目标物的检测。同基因编辑应用一样，最早用于分子检测的CRISPR/Cas系统是CRISPR/Cas9系统，如CRISDA技术（Zhou et al. Nat. Commun. 2018）、CRISPR Chip技术（Hajian et al. Nat. Biomed. Eng. 2019）、FLASH-NGS技术（Quan et al. Nucleic Acids Res. 2019）等。这些技术利用的是CRISPR/Cas9系统的顺式切割活性，作用于目标DNA分子。有趣的是，最新研究发现，除了顺式切割，CRISPR/Cas9系统也具备反式切割活性（Chen et al. Nat. Biotechnol. 2024），同样可用于分子检测。这一成果的公布再次验证：科学认识是不断发展的，甚至存在悖论。与CRISPR/Cas9系统不同，CRISPR/Cas12系统和CRISPR/Cas13系统用于分子检测利用的是反式切割活性，是对周围非目标DNA/RNA分子的无差别切割。当这些非目标DNA/RNA分子被功能化时，就可以充当荧光、显色、电信号等来源，实现对目标物的传感。很明显，顺式切割中目标物与信号的传感模式是“1对1”，效率低，而反式切割中是“1对n”，效率高。这也是为什么目前应用最为广泛的是CRISPR/Cas12和CRISPR/Cas13检测。

得益于Cas12a、Cas12b和Cas13a等Cas酶的商业化，CRISPR/Cas检测研究如雨后春笋，不断涌现。纵使CRISPR/Cas检测“花样百变”，无外乎“扩增”和“非扩增”型两类策略。扩增型CRISPR/Cas检测的检测效率极高，可达到aM级别，但需要与核酸扩增体系相结合，成本高，操作相对复杂；非扩增型CRISPR/Cas检测虽然操作简单、成本低，但检测效率低，无法直接满足痕量检测，需借助微流控液滴、电场作用等空间浓缩，或信号的级联放大等策略。所以，二者的应用场景是截然不同的，取决于目标物类型以及是否为痕量检测等。当然，我们所分析的目标物，可以是生物性的，如核酸、蛋白质等，也可以是非生物性的，如重金属离子、小分子化学物等。

CRISPR/Cas检测技术虽然突飞猛进，但其推广使用目前陷入窘境。推广窘境的首要原因在于试剂成本过高。当前，CRISPR/Cas检测，尤其是扩增型CRISPR/Cas检测，其成本是PCR的几倍甚至几十倍。一般人或基层机构是难以承受的。试剂成本高，一方面在于现有商业化的Cas12a、Cas12b和Cas13a等Cas酶存在专利保护，酶价格高居不下；另一方面在于核酸扩增体系和高浓度、短链标记探针的共同使用，整体检测成本成倍增加。除了试剂成本过高，CRISPR/Cas检测技术的技术瓶颈也是导至推广窘境的重要原因之一。技术瓶颈一，体系复杂，成分兼容性待提升，暂时无法像PCR试剂那样做成预混式Master Mix。虽然许多研究者或者试剂厂商陆续推出了一管式、一锅法甚至冻干型CRISPR/Cas检测试剂，但能否像PCR Master Mix那样操作简便、性能稳健，还有待深入探究；技术瓶颈二，一管多重难度大，暂时无法像多重PCR试剂那样只需单一聚合酶即可实现一锅法单管多重检测。现有的CRISPR/Cas多重检测技术，往往涉及复杂的操作过程（可能会引起气溶胶污染）、多种类的Cas酶和探针的使用（试剂成本再次增加）等。

那CRISPR/Cas检测的破局在何处？其实很明显，一是要控成本，二是要促兼容，三是要搞多重。当然，这些想法仅限于分子检测研究。“控成本”意味着要大力研发具有自主知识产权的酶原料，方能“减少中间商赚差价”；“促兼容”需要对核酸扩增反应、蛋白酶性质、探针修饰、缓冲液类型等做改进、优化，甚至重塑，方能真正混合兼容，且不影响检测性能；“搞多重”其本质是提高目标同时检测的数量，缩短检测周期，方能去解决“n-n”高通量、多目标的定性定量检测终极目标。什么样的分子检测技术能走入“千家万户”？当然是越简单、越便宜，同时性能又优越的分子检测技术。然而，正如“灵敏度”和“特异性”的关系一样，“简单便宜”和“性能优越”二者很难兼得，要讲究平衡。现阶段，CRISPR/Cas检测研究正如火如荼，但不要忽视应用基础研究。在某些角度上，“夯基石”的研究可能更为重要。各位看官，您觉得呢？

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