PCR实验室发生核酸气溶胶污染怎么办？

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分子生物学，分子实验室，PCR实验，PCR假阳性

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首先说一下发生气溶胶的原因是什么？有以下几种可能：
1.电泳过程敞开电泳槽盖子，核酸在电泳槽堆积，随着电泳缓冲液的温度升高而挥发在空气中。
解决办法：倒掉原来的电泳缓冲液，反复清洗电泳槽，重新更换电泳缓冲液。只需要购买电泳缓冲液即可。
2.PCR过程中管盖弹开，或者PCR管质量不过关，盖子裂开，核酸挥发在空气中。
解决办法：使用优等PP材质，优质模具注塑，已经灭菌即可使用的质量较好的薄壁管，避免PCR管在高温下炸裂变形。为什么要使用已经灭菌或者无酶的PCR管？因为PCR管能够承受的使用次数有限，如果使用未处理过的PCR管，那么你一定会再进行一次高温高压灭菌，这个过程中相当于PCR使用了一次，你使用的时候已经是第二次了。同时，经过无酶处理的PCR管，一定是质量比较好的，质量不好的，商家也没必要在进行灭菌处理，当便宜货卖。
3.实验室太过于封闭，长期核酸堆积。
解决办法：其实无论是哪种方法，开窗户通风都是必须做的选项，当然，光是通风肯定是不够的，实验室应该定期进行核酸清洁工作，否则出现假阳性在所难免。推荐一款核酸清洁剂，无毒无害，无污染，无腐蚀。有需要的联系Thankyou_baby，为你解决实验难题。

同花顺

最全攻略：PCR验室假阳性核酸气溶胶污染应对策略 - 纳克nake的文章 - 知乎 https://zhuanlan.zhihu.com/p/401946111

检验医师

实验人不请自来！



不知道大家在做分子实验时，是否也会被假阳性所困扰？核酸污染问题是否让你的实验焦头烂额？想知道如何最大程度降低PCR实验污染概率，确保检验结果的准确性，接下来，就跟随小V一起，先认识认识这其中的罪魁祸首之一——气溶胶污染。
何为气溶胶？
气溶胶是指悬浮在气体介质中的固态或液态颗粒所组成的气态分散系统。这些固态或液态颗粒的密度与气体介质的密度可以相差微小，也可以悬殊很大。对于司法鉴定、第三方检测机构等感染源检测实验室而言，PCR污染一直是一个令人苦恼的问题。PCR核酸检测特异性强、灵敏度高，对疾病的诊断起着至关重要的作用，但在操作过程中易受到污染，导致假阳性的结果[1]，其中最常见且最难消除的污染就是气溶胶污染。


PCR产物的污染主要发生在PCR产物分析阶段，因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml），所以极微量的PCR产物就会造成假阳性。另外，因为在空气与液体面摩擦时会形成气溶胶，所以比较剧烈地摇动反应管, 开盖时吸样，以及反复吸样都可形成气溶胶污染。除了PCR产物分析过程中造成的污染外，模板本身也可能是一个污染源。比如常用的作为阳性对照的质粒，其浓度非常高，造成污染的可能性也非常大[2]。那么，我们如何将污染的概率降到最低呢？

有效控制
首先我们要做的就是污染的控制，合理的管理和操作，尽可能降低污染的可能性，从源头控制污染。
✦（1）合理分隔实验室
将样品处理、PCR反应液的配制、PCR扩增以及产物鉴定步骤分区进行。进行分区时要注意各区独立、注意风向、因地制宜、方便工作。其他建立物理障碍的方法还包括使用带滤芯的枪头，尤其是在试剂准备区和产物分析区。



图片来自《实时荧光PCR技术》

✦（2）实验室管理
因为漂浮在空气中的核酸分子难以消除，部分可附着在检测人员的衣物上，随着人或物的流通而进一步污染整个实验室, 所以进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂准备区、标本制备区、扩增区至产物分析区，避免发生交叉污染。而且每一区域都须有专用的仪器设备并明确的标记，以避免不同的工作区域间设备物品发生混淆，从而造成交叉污染。
✦（3）阳性对照
阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本对检测或扩增样品污染的可能性很大，因此在实验过程中尽量减少使用拷贝数过高的阳性质粒作为对照。
及时监测
除了有效控制外，及时监测也是防止污染中非常重要的一环。
✦ 阴性质控
在实验过程中添加阴性提取对照、无模板对照等阴性质控品来检验体系中的污染，以确保对污染的及时发现。

有效处理
最后，当污染真的出现时，我们该如何有效的处理呢？
✦（1）紫外线
由于DNA链上相邻的嘧啶在254mn[3]紫外诱导下发生交联，嘧啶二聚体不能被切除，导致DNA聚合酶在空间上被阻碍或者DNA不能被完全变性，从而使合成反应终止。实验结束后打开实验室各区域的紫外灯进行紫外消毒，照射时间≥1h[4]，由于小的扩增子只有较少的临近嘧啶，所以该方法对小的扩增子效果不明显。
✦（2）尿嘧啶-DNA-糖基酶（UDG）
其原理是用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UNG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的 N-糖基键，可除去dU而阻止Taq DNA聚合酶的延伸，从而消除PCR产物的残留污染。
✦（3）次氯酸钠
次氯酸钠具有氧化损伤核酸的作用，从而使留在实验室的扩增产物被破坏掉。先用75%酒精对实验室空气进行密集喷淋，以对实验过程中生成的气溶胶产生较好的沉降效果。喷淋结束立即采用次氯酸钠擦拭工作台面/拖擦地面，作用10min后用清水擦拭工作台面，并保持通风。

核酸检测实验室污染的防治措施包括但不限于以上几种，为了避免由于污染造成的假阳性等现象，保证检测结果的准确性，检测人员应严格遵守操作规程，把“防污染”贯穿于整个实验过程中。

参考文献：
[1] Kwok S. Higuchi R. Avoiding false positives with PCR [J]. Nature, 1989, 339(6221): 237.
[2] Munoz N. Bosh FX. de Sanjose S. et al. Epidemiogic classification of human papilomavirus types associated with cervical Cacer [J]. N Engl J Med, 2003, 348(6): 518-527.
[3] Gordon L.K. and Haseltine W.A. 1982. Quantitation of cyclobutane dimer formation in double- and single-stranded DNA fragments of defined sequence. Radiat. Res. 89: 99-112.
[4] 郭灵安,雷绍荣,宋君.紫外线清除实验室转基因物质污 染 的 效 果 研 究 [ J ] . 中 国 消 毒 学 杂 志 , 2015 , 32 ( 5 ) : 437 - 439 .

卡卡

核酸气溶胶污染应如何防止？

• 实验分区。PCR实验室按《医疗机构临床扩增实验室管理办法》 （卫办医政发〔2010〕194号）[2] 规定进行分区，工作和空气流向都严格按照试剂准备区→标本制备区→PCR扩增区→产物分析区。
  
• 规范操作。实验过程中，正确穿戴好防护服，佩戴手套，手套要紧密贴合拇指、食指和中指，避免开盖操作时产生交叉污染。
  
• 常规操作清洁。每天多批次检测时，在每一批次检测完以后必须用75%的乙醇或核酸清洗液（如：朗司医疗的清洗液PCR Cleaner）进行去污处理。
  
• 重视通风：不定期对房间进行通风，每次至少持续30min。
  
• PCR扩增区去污染：PCR反应管必须盖紧，避免扩增后的核酸对环境的污染。
  
• 核酸气溶胶污染产生不是瞬间的事情，而是一个累积的过程。如果我们在日常实验中，就有目地性的规避，规范操作，做好清洁消菌，能很大程度上避免核酸气溶胶污染。
  

如果真的发生核酸气溶胶污染，要如何防治？

• 目前实验室中，出现核酸气溶胶污染，处理的常规方法有：酒精擦拭、紫外线照射、高压变性。值得注意的是，要祛除DNA污染而不是仅仅灭菌的话，常规紫外线照射建议应延长至2小时，即使这样，紫外照射对祛除小片段（200bp以下）的DNA污染效果仍然不佳。
  
• 可见，常规的做法不仅耗时多，而且效果不尽如人意。
  
• 在疫情重过天，时间就是生命的今天，每个实验室都禁不起这种时间的消耗浪费。在《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行）》中明确提出：“核酸实验结束后，必要时可采用核酸清除剂等试剂清除实验室残留核酸”。[3] 可见，核酸气溶胶污染也应用专业的实验室污染清洗液PCR Cleaner祛除，快速、高效、省时省力。你只需拿起清洗液PCR Cleaner A瓶在目标表面轻轻喷涂3次，用干净的纸巾擦拭，再用B瓶重复上述动作，全程只需几分钟，就能让你从繁琐的事后清理中解放出来。今晚终于可以放心的下班了。
  

参考文献：

• [1] 新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）
  
• [2] 《医疗机构临床扩增实验室管理办法》 （卫办医政发〔2010〕194号）
  
• [3] 《医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行）》
  

检验医师

首先搞清楚为什么会产生气溶胶污染以及气溶胶污染的环节。
环节1.核酸提取环节，这时候你所用的移液器是直接吸取核酸溶液的，一些气溶胶理论上会进入到移液器里，假如你再用这些移液器进行PCR操作，就有产生气溶胶污染的可能。
环节2.PCR结束，进行PCR产物电泳时，这时候样品核酸经过PCR反应，产物的浓度百万倍增加，移液器吸取PCR产物进行电泳，这时候加样的移液器百分百会被气溶胶污染，假如你用电泳点样的移液器再去进行PCR操作，不污染才怪呢。
污染防控：
1.核酸提取区域和PCR加样区域以及电泳区域一定要物理性分割开来，最好都是在各自的独立区操作，包括所用的移液器，每个区域都要有每个区域专用的移液器。像我实验室，这些区域都是被分隔开的。
2.实验室尽量不要采用全封闭式的，全封闭式的实验室看起来好看，用起来你就知道了，一旦一个区域产生气溶胶污染，打开排风机是没用的，效果远远没有打开窗户通风换气的效果好。