限制性内切酶——“分子手术刀”

会里很

限制酶的生物学功能源于抵御入侵细胞的外源DNA。细菌的限制-修饰系统使细菌自身的DNA碱基被甲基化修饰，从而不被自身的限制性内切酶识别切割。


限制性内切酶的发展



上世纪60年代初Werner Arber提出一种设想：有一种酶，可以切断病毒的DNA来限制病毒增殖。

Kent Wilcox和Hamilton Smith发现了第一种II型限制性内切酶Hind II，使得限制性内切酶得到充分利用，Hind II能够精准“处决”DNA[1]，同时他们还发现了甲基化酶可以通过甲基化修饰，保护细菌原有DNA免受Hind II的攻击。

Kathleen Danna和Daniel Nathans通过研究流感嗜血杆菌限制酶对SV40 DNA的特异性切割[2]，得到限制性内切酶图谱。

Daniel Nathans、Hamilton Smith和Werner Arber凭借在限制酶领域开创性的研究，共同获得1978诺贝尔生理学或医学奖。

截至目前，科学家已从原核生物中分离出多种限制酶，限制酶已成为基因工程中重要的“手术刀”，并且已经商品化，在基因工程中广泛使用。


限制性内切酶的分类



根据限制酶的亚基组成、识别位点、酶切位置、辅因子、作用方式等因素，可将限制酶分为三种类型，分别是I型、II型、III型。


表 1 限制性内切酶分类表




I型和III型限制性内切酶因未能产生特定的切割片段，因而不具备实用价值，Ⅱ型限制性内切酶已被广泛应用于DNA分子克隆和序列分析，这是因为它们水解DNA不需要ATP，且也不以甲基化或其他方式修饰DNA，最重要的是它们在识别序列内或附近切割双链DNA。

Ⅱ型限制性内切酶的切割序列常常是4-6 bp回文结构，这种酶有两种切割方式，一种是交错切割，形成粘性末端，另一种是在同一位置上切割双链，产生平末端。

II 型限制酶又可进一步细分为 IIP、IIA、IIB、IIC、IIS 等小类别，其中，IIS型限制酶可以在离它的不对称识别位点一侧下游的特定距离处切割DNA双链，这是由于此类限制性内切酶的识别序列和催化区域被一个连接多肽分开；

IIS型限制酶的一个突出特点是对切割位点的序列没有要求，也就是可以识别序列外的任意核苷酸序列（常见IIS酶切位点如图1所示）[3]。根据这一特性，在mRNA体外合成过程中，Poly（A）尾巴可以通过质粒DNA模板限制切割和转录获得，这一种方式能够在mRNA产品中加入特定数目的Poly（A）。

IIS型限制酶克隆的优势：
· 单一管中进行克隆：由于连接产物中酶切位点消失，所以酶切和连接可以在同一反应管中进行。
· 无痕克隆：不会引入多余序列。
· 同时组装多个片段：使用正确的互补末端组合可以同时组装多个片段。




图1. 常见IIS限制酶酶切位点


限制性星号活性



星号活性( star activity ) : 是同一类限制性内切酶在某些反应条件变化时，酶切割位点的专一性发生改变，例如酶浓度过高、反应液离子强度过低、pH改变等。

大多数星号活性是可以控制的，做酶切反应时一般不需考虑这方面的因素，只要在正常条件下，使用随酶提供Buffer，酶就不会出现星号活性。


影响限制性内切酶活性的因素

· DNA纯度：DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性，一般通过纯化DNA、加大酶的用量、延长保温时间和扩大反应体系来改善。
· DNA甲基化程度：大肠杆菌一般有dam和dcm两种甲基化酶修饰质粒，基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。
· 温度：不同限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37˚C，少数要求40-65˚C。
· 缓冲液：缓冲液是影响限制酶活性的重要因素，商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。


【参考文献】
[1] KELLY T J, JR., SMITH H O. A restriction enzyme from Hemophilus influenzae. II [J]. J Mol Biol, 1970, 51(2): 393-409.
[2] DANNA K, NATHANS D. Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1971, 68(12): 2913-7.
[3] ENGLER C, KANDZIA R, MARILLONNET S. A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability [J]. PLoS One, 2008, 3(11): e3647.



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