什么是分子胶，和PROTAC有什么区别？靶向蛋白降解剂的原理及开发？

幸福侠侣

什么是分子胶，和PROTAC有什么区别？靶向蛋白降解剂的原理及开发？
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继续前进

“分子胶水”的发现
“分子胶水”，顾名思义，它就像一种粘合剂，通过特异性指引两种或多种大分子结合在一起，进而产生特定的生物学效应。人们对于这种分子的认知，经历了一个较为漫长的过程。

1881年，生物学家的达尔文和他的儿子弗兰西斯首先利用金丝雀翳（yi）草的胚芽鞘进行植物向光性实验。研究发现植物胚芽鞘尖端产生的某种物质，在单侧光照射条件下会影响植物胚芽鞘、根和茎的生长方向。1942年，植物学家Kenneth V. Thimann成功分离并鉴定出该物质是一种吲哚乙酸，可以促进植物生长，故取名为“生物素”。之后的研究证明生长素是一种关键的植物激素，能调控植物生长和发育的许多方面，但是生物素如何调控基因的表达仍是未知之谜。



▲生物素的发现（来源：American Journal of Botany, 1942, 29, 598）

直到2007年，第一个被鉴定为“分子胶水”的小分子——生物素的作用机制才被完全揭示［1］。通过研究拟南芥TIR1-ASK1复合物的晶体结构，研究人员发现生物素可以填充进蛋白界面的一个疏水室，像胶水一样与植物中的TIR1(Transport Inhibitor Response 1, 转运抑制应答因子1, 泛素连接酶SCFTIR1的亚结构域) 结合，同时它也会结合底物蛋白Aux/IAA（一种转录抑制子），进而调控TIR1-Aux/IAA复合体的形成。通常情况下，底物蛋白Aux/IAA在被修饰前会与TIR1解离，但TIR1和生长素结合后形成了一个完整的表面结构，使底物蛋白Aux/IAA与TIR1的结合更加紧密，难以解离，进而发生泛素化，最终被蛋白酶体降解。

泛素化与PROTAC技术的诞生
1976年，以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose在研究红细胞裂解物的过程中发现，有一种多肽可以启动蛋白降解过程，后来证明这个多肽就是泛素(Ubiquitin,Ub)。而他们也因揭示了泛素调节的蛋白质降解过程荣获2004年的诺贝尔化学奖。




▲2004年获得诺贝尔化学奖的三位科学家（来源：The Nobel Foundation）

基于这个重大发现，有学者提出：是否可以利用泛素介导蛋白降解机制，人为降解一些蛋白？

2001年，受“分子胶水”和泛素化的启发，融合了靶蛋白识别和介导蛋白降解的PROTAC(PROteolysis TArgeting Chimera)技术应运而生。美国两院院士Deshaies和Crews博士等人首次提出了PROTAC概念，并成功地设计和合成了第一批PROTAC小分子用于降解甲硫氨酰氨肽酶2(MetAP-2)。



▲PROTAC分子结构   

PROTAC小分子一端是结合靶蛋白的配体，另一端是结合泛素连接酶E3的配体，二者通过链接子相连。PROTAC分子进入细胞后，靶蛋白的配体端负责结合靶蛋白(Protein of Interest, POI)，E3的配体端负责结合泛素连接酶E3，形成POI-PROTAC-E3连接酶的三元复合物。通过耦联泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome pathway, UPP)，介导靶蛋白POI被贴上泛素“标签”，而带有多个泛素“标签”的POI会被蛋白酶体识别并降解，使靶蛋白的浓度被选择性地降低。

DEL技术与PROTAC分子的构建
PROTAC分子的构建体系，包括靶蛋白的筛选、靶蛋白的制备和连接子的选择等，同时兼顾靶蛋白-双功能小分子-E3连接酶的三元复合体的形成。



▲PROTAC分子构建的工作流程

DNA编码化合物库(DNA Encoded Library, DEL)是一种用来筛选苗头化合物的新技术。DEL分子一端是小分子化合物，另一端是对应的DNA标签，中间是一段连接子。通过二代测序技术，我们可以方便地读取DNA标签信息，进而推断出小分子化合物信息。每个“分子积木”都有一段专属的DNA标签对其进行标记，在DEL分子完成化学反应连上“分子积木”时，其对应的DNA标签即可通过酶连反应进行添加，确保识别的唯一性。
同时，“分子积木”的排列组合与DNA标签的排列组合一一对应，确保每一个新合成的小分子化合物都具有唯一的DNA标签。DEL库的合成基于“Split and Pool”的方法，通过不同“分子积木”间的排列组合，可以快速地合成海量的小分子化合物。DEL库中的化合物容量超过百亿个，覆盖了绝大多数成药化合物的化学空间。通过解码亲和筛选后获得的DNA序列，就能快速找到与靶蛋白结合的小分子。




▲DEL分子与PROTAC分子

PROTAC分子作为一种特殊的双功能小分子，它的结构设计与DEL分子高度一致。由于DEL分子中也包含了一个连接子，因此可以提示构建PROTAC分子时连接子的最佳位置，如果基于现有的DEL分子来设计 PROTAC分子，药物研发速度和效率将得到了极大的提升。
与基于功能的高内涵筛选(High Content Screening, HCS)和高通量筛选技术(High Throughput Screening, HTS)不同， DEL筛选技术打破了以往一对一的筛选模式，在以下几个方面的做到了创新：
>> 基于亲和性筛选，确保靶蛋白和配体间存在物理结合
>> 海量化合物容量的DEL库，实现了小分子结构的多样性和创新性
>> 筛选所需蛋白耗量少，周期短和多靶点/条件平行筛选

靶向性PROTAC分子构建完成后，还需要通过一系列的生物物理学、生物化学等综合性检测，才有机会进入临床实验阶段。全流程归纳如下：



▲PROTAC分子介导靶蛋白降解工作流程图

第一步：如何成功构建PROTAC分子；
第二步：PROTAC分子能否成功穿透并进入细胞；
第三步：一旦进入细胞，靶蛋白-PROTAC分子-E3连接酶的三元复合物能否形成；
第四步：能否形成活化的E3复合体；
第五步：靶蛋白能否被泛素化；
第六步：泛素化的靶蛋白能否被蛋白酶体识别并结合；
第七步：靶蛋白是否发生降解。

经过20年的探索和发展，PROTAC技术现在已经在药物研发领域初露锋芒。借助先进的生物物理学和结构生物学方法，科学家可以针对以往难以成药的靶点，自主构建PROTAC分子。通过使用“分子胶水”或更为复杂的分子结构，突破传统小分子药物的局限性，精准调控一些重要的生物学过程，如转录、信号级联反应、蛋白质折叠和降解等，进而发挥作用, 争取实现“指哪打哪”的战略目标。

结语

有成千上万种致病的蛋白，传统小分子药物仅能针对位于细胞表面的一小部分发挥作用。而绝大多数致病蛋白都位于细胞内或核内，且表面相对平滑，生物大分子和小分子药物皆无能为力。

而泛素化参与调控细胞周期、增殖、凋亡、分化等大量生命活动，在蛋白质的降解等过程中起重要作用，与肿瘤、心血管、自身免疫等疾病的发病密切相关。PROTAC技术利用人体泛素—蛋白酶体降解系统，打破了药物设计的传统观念。大量临床前和临床研究表明，PROTAC小分子药可采用口服在内的多种给药途径，给药后在人体组织器官中分布广泛。由于PROTAC分子降解靶蛋白的作用机制类似催化剂，除了具有用量小，利用率高等优势，还能避免靶蛋白突变产生的耐药性。
通过技术的革新，PROTAC技术重新定义了小分子药物，为新药研发开拓了新的方向。

参考资料：
1.Tan, X., Calderon-Villalobos, L., Sharon, M. et al. Mechanism of auxin perception by the TIR1 ubiquitin ligase. Nature 446, 640–645 (2007).
2.Asatsuma-Okumura, T.; Ito, T.; Handa, H. Molecular Mechanisms of the Teratogenic Effects of Thalidomide. Pharmaceuticals 13, 95(2020).

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检验医师

来源：药渡
撰文：balabala
靶向蛋白降解（Targeted protein degradation, TPD）在过去二十年中作为一种主要的新型药物模式已被广泛用于多种蛋白，为癌症、炎症等疾病治疗提供了一种潜在的有前途的治疗策略。
其中，蛋白降解靶向嵌合体（Proteolysis targeting chimeras，PROTAC）作为一种有潜力的靶向蛋白降解技术，它是具有E3泛素连接酶招募者与感兴趣蛋白（POI）配体连接的异双功能小分子，通过诱导E3泛素连接酶与POI靠近实现靶蛋白降解。PROTAC分子具有高效、低耐药性等特点，同时能靶向“不可成药”蛋白，其应用前景十分广泛。
之后，受PROTAC的启发，去泛素化酶靶向嵌合体（deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTACs）成功问世，用于靶向蛋白质稳定（targeted protein stabilization，TPS）。接下来，我们就来重点介绍一下靶向蛋白降解技术和靶向蛋白稳定技术（图1）。




图1. 靶向蛋白降解技术和靶向蛋白稳定技术作用机制示意图
01
细胞内靶向蛋白降解(iTPD)
近年来，细胞内靶向蛋白降解（intracellular targeted protein degradation，iTPD）已成为小分子药物新的重要模式（图2）。在这里，构建了异双功能小分子，招募感兴趣的药物靶蛋白（POI）和E3连接酶，用于蛋白酶体降解。目前，已经开发出两类这样的分子。
PROTAC
蛋白质水解靶向嵌合体（Proteolysis-targeting chimeras, PROTACs）由Crews和Deshaies团队首创，是由一个linker连接的大的特异性小分子；一部分与POI结合，另一部分与E3连接酶结合，使POI泛素化，被细胞质中的蛋白酶体降解。
分子胶
第二类被称为分子胶，是利用小分子化合物通过非共价作用与病理蛋白结合，形成大的稳定复合物，阻止病理蛋白的功能。在这种情况下，分子胶增强了E3连接酶和POI之间的相互作用，导致其泛素化和降解。相关文章回顾：继PROTAC之后的新型蛋白降解剂：分子胶。
由于PROTAC与E3连接酶和POI具有独立的结合位点，因此比分子胶更容易设计。然而，它们通常是大分子，开发起来很有挑战性，而基于lipinski五规则等指导原则，分子胶通常更小，更像药物。值得注意的是，雷帕霉素、FK506和环孢菌素等天然产物胶都是较大的分子，但仍可口服生物利用，它们代表了临床使用的分子胶的很大一部分。




图2. 细胞内靶向蛋白降解(iTPD)示意图
与传统的基于“占位驱动”的小分子抑制剂相比，iTPD具有显著的优势。

• 首先，PROTACs发挥作用取决于靶蛋白和E3连接酶的空间邻近，属于“事件驱动”的作用模式。PROTAC具有催化特性，只需提供与靶蛋白的结合活性，无须直接占据靶蛋白的活性口袋、有助于攻克小分子难以成药的靶点。
  
• 其次，PROTAC发挥作用时直接将靶蛋白降解，克服了传统小分子药物容易导致的靶蛋白过表达及突变等耐药性问题。
  
• 第三，由于PROTAC的生效机制类似催化反应，因此只需要极低剂量即可发挥效用，较低的给药浓度使PROTAC药物的安全性较高。
  

目前，已有ARV-110、ARV-471、KT-474和DT2216等多个PROTAC分子进入临床试验阶段。与PROTAC相比，分子胶有更小的分子量（通常小于600Da）、更好的膜通透性和成药性，但分子胶并不等同于“去掉连接子的PROTAC”。分子胶通过诱导或稳定E3连接酶与靶蛋白之间的“蛋白-蛋白相互作用”（protein−protein interaction，PPI），介导靶蛋白泛素化和随后的蛋白酶体降解。
分子胶的发现多是偶然的，最具代表性的是IKZF1/3降解剂沙利度胺、来那度胺和泊马度胺。在此基础上，研究人员通过合理的结构优化得到了CC-92480（IKZF1/3降解剂）和CC-90009（GSPT1降解剂）等进入临床试验阶段的分子胶（图3）。




图3. 分子胶与PROTAC的作用方式及结构特点
02
细胞外靶向蛋白降解(eTPD)
细胞外蛋白质组由分泌蛋白和膜结合蛋白组成，涵盖了生长因子、细胞因子、激素、酶和受体等多种蛋白质，它们在细胞信号传导、免疫反应、组织修复和新陈代谢中扮演重要角色。由于许多疾病与细胞外蛋白的失调有关，因此，细胞外蛋白质被认为是药物研发中的一类重要治疗靶点。
近年来，细胞外靶向蛋白降解（extracellular targeted protein degradation，eTPD）技术的出现，为研究人员提供了一种全新的模式来调节细胞外蛋白质组。不同于传统基于“占位驱动”的药物，eTPD技术运用双特异性生物制剂或小分子招募细胞外蛋白，将细胞外蛋白质运送到溶酶体进行选择性降解，这种独特的作用方式拓展了可治疗的靶点范围，为治疗多种疾病开辟了新的可能性（图4）。




图4. 细胞外靶向蛋白降解(eTPD)示意图
目前，降解细胞外蛋白质主要有六种不同的方法策略，分别是降解可溶性POI的清除抗体eTPD、基于聚糖的循环受体eTPD、基于跨膜E3连接酶靶向膜蛋白的eTPD、基于细胞因子靶向膜蛋白的eTPD、基于整合素的eTPD、从内部降解膜蛋白的eTPD。
NO.1
降解可溶性POI的清除抗体eTPD
降解可溶性POI的清除抗体eTPD是“清除抗体”（sweeping antibodies）分子经过工程改造，增强了它们与Fc回收受体、新生儿Fc受体（FcRn）或FcγRIIb的结合能力。可以使工程化抗体通过FcRn，以pH可切换的方式将POI递送到酸性内体，酸性内体释放POI进行溶酶体降解。
Tocilizumab（Tcz）是一种被批准用于治疗类风湿性关节炎的人源化抗体。pH可切换的Tocilizumab于2020年被批准用于治疗视神经脊髓炎谱系障碍，这代表了eTPD中第一个被批准的抗体。
NO.2
基于聚糖的循环受体eTPD
基于聚糖靶向的再循环受体，如阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体（CI-M6PR）可以促进膜和可溶性POI的溶酶体降解。其中，溶酶体靶向嵌合体（LYTAC）就是利用LYTAC–POI复合物与CI-M6PR结合后被内化，导致POI在溶酶体中降解。
NO.3
基于跨膜E3连接酶靶向膜蛋白的eTPD
基于跨膜E3连接酶靶向膜蛋白的eTPD是利用靶向含有跨膜结构域的E3连接酶家族成员和POI的双特异性抗体降解靶蛋白，被称为AbTACs或PROTAB。
NO.4
基于细胞因子靶向膜蛋白的eTPD
基于细胞因子靶向膜蛋白的eTPD，如细胞因子受体靶向嵌合体（KineTAC）也是一种双特异性抗体，KineTAC一端结合细胞因子或生长因子，而另一端结合POI。从而实现膜结合型和可溶性蛋白的降解。
NO.5
基于整合素的eTPD
利用整合素促进的溶酶体降解技术是使用双特异性抗体的一端结合整合素，而另一端结合POI，从而将POI引导至溶酶体进行降解，同时利用整合素的循环能力来增强目标定位和效率。
NO.6
从内部降解膜蛋白的eTPD
从内部降解膜蛋白的eTPD则涉及PROTACs技术，这类分子一部分用于结合受体酪氨酸激酶的细胞内激酶结构域，而另一部分与细胞质中的E3连接酶结合，通过泛素蛋白酶体途径进行降解。PROTACs技术为靶向细胞内蛋白质提供了一种高效的降解策略（图5）。




图5. 降解细胞外蛋白质的六种不同方法策略
03
靶向蛋白稳定（TPS）
2022年初，美国加州大学伯克利分校的Daniel Nomura教授团队与诺华生物医学研究所（NIBR）的研究人员合作，开发了一种新的治疗模式，它被称为去泛素化酶靶向嵌合体（Deubiquitinase Targeting Chimera ，DUBTACs）。
DUBTACs是一种异双功能小分子，由一个与蛋白质靶向配体和去泛素化酶招募者组成，DUBTACs发挥作用的大致过程为：DUBTACs一端结合靶蛋白（POI），一端结合去泛素化酶，诱导靶蛋白与去泛素化酶的靠近，从而去除泛素链，以阻止蛋白酶体介导的靶蛋白的降解，达到稳定以泛素依赖方式降解的特定蛋白质的水平（图6）。
在这项研究中，研究人员利用DUBTACs，提高了一种名为CFTR的氯离子通道蛋白突变体的稳定性。通常这种突变体的降解，会导致严重的囊性纤维化（CF）疾病。研究结果显示，靶向CFTR的DUBTACs，能够恢复从囊性纤维化患者体内获得的原代人类支气管上皮细胞的氯离子通道功能。研究结果同时显示，DUBTACs可以被用于治疗癌症。他们开发了一款能够稳定肿瘤抑制蛋白WEE1激酶的DUBTAC。WEE1激酶在很多肿瘤中被主动降解，从而促进癌细胞的增生，稳定癌细胞中WEE1激酶的水平可能终止肿瘤的生长。
不久后，美国哈佛医学院的魏文毅教授团队和西奈山伊坎医学院的金坚教授团队，使用EN523招募去泛化素酶OTUB1进一步开发了能够稳定抑癌蛋白的首个TF-DUBTAC药物平台，旨在通过稳定抑癌转录因子（Transcription Factor，TF）实现对肿瘤的治疗。




图6. DUBTACs作用示意图
总体来说，DUBTACs作为一种较新的疗法，进行的研究和开发还相对较少，但也已经在某些特定的案例中展现出了治疗潜力，TPD和TPS的兴起代表了药物发现领域的一次重大突破。鉴于其在癌症治疗、免疫调节、神经退行性疾病以及传染病等领域的应用潜力，TPD和TPS正显现出作为一种多功能性治疗策略的广泛意义。
参考文献：
[1]Wells JA, Kumru K. Extracellular targeted protein degradation: an emerging modality for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2023 Dec 7. doi: 10.1038/s41573-023-00833-z.
[2]Dong G, Ding Y, He S, Sheng C. Molecular Glues for Targeted Protein Degradation: From Serendipity to Rational Discovery. J Med Chem. 2021 Aug 12;64(15):10606-10620. doi: 10.1021/acs.jmedchem.1c00895
[3]Henning NJ, Boike L, Spradlin JN. Deubiquitinase-targeting chimeras for targeted protein stabilization. Nat Chem Biol. 2022 Apr;18(4):412-421. doi: 10.1038/s41589-022-00971-2.
[4]Liu J, Yu X, Chen H, Kaniskan HÜ, Xie L, Chen X, Jin J, Wei W. TF-DUBTACs Stabilize Tumor Suppressor Transcription Factors. J Am Chem Soc. 2022 Jul 20;144(28):12934-12941. doi: 10.1021/jacs.2c04824
*声明：本文仅是介绍医药疾病领域研究进展或简述研究概况或分享医药相关讯息，并非也不会进行治疗或诊断方案推荐，也不对相关投资构成任何建议。内容如有疏漏，欢迎沟通指出！

长长的路

一、PROTAC的结构和作用机理

关于PROTAC的结构和作用机理，要从泛素-蛋白酶体通路讲起。2004年诺贝尔化学奖颁发给了Aaron Ciechanover、Avram Hershko和Irwin Rose，因为他们发现了泛素介导的蛋白质降解。



图1：2004年诺贝尔化学奖

泛素（Ubiquitin）是一种由76个氨基酸组成的小蛋白，存在于所有已知的真核生物体中。泛素化过程主要由泛素激活酶E1，泛素结合酶E2和泛素连接酶E3介导。其中E1酶和E2酶参与的过程称为泛素的激活；E3酶与靶蛋白特异性结合，并催化泛素分子转移靶蛋白上，这一过程称为蛋白质的泛素化。经过这两个过程后，靶蛋白被泛素标记，最终被蛋白酶体（Proteasome）识别切割成小片段，实现靶蛋白的特异性降解（图2）。



图2：泛素介导的蛋白质降解过程[1]

PROTAC，即蛋白水解靶向嵌合物，就利用了这一天然的蛋白降解机制。作为一种双功能分子，PROTAC由三个关键结构成分组成：一侧分子区域可结合E3连接酶，另一侧分子区域可结合靶蛋白，中间区域为接头分子（Linker）。



图3：PROTAC的结构示例

PROTAC依靠拉近E3连接酶和靶蛋白的距离，诱导E3连接酶为靶蛋白贴上泛素标签，继而促进靶蛋白的降解，靶蛋白降解后掉落下来的PROTAC分子可以继续地被循环利用（图5）。
我们知道，大多数小分子药物需要与酶或受体的活性位点结合才能发挥作用，这种作用机制被称为占据驱动模式，但是PROTAC可以通过任何一个角落、裂缝抓取蛋白从而降解蛋白，它不需要占据一个活跃的口袋工作，也不需要依赖靶标占有率来破坏靶标蛋白的功能，我们称之为事件驱动的药理学机制，也因此PROTAC为很多无活性位点的不可成药蛋白靶点的开发带来了希望；它还有望克服小分子的一些缺点比如耐药性，同时保留其直接作用于细胞内靶点的优势；且与抗体或寡核苷酸相比具有更高的口服生物利用度，还可以减少生产方面的挑战。



图4：PROTAC的作用机理[2]

二、分子胶

PROTAC由三个部分组成：两个独立的配体和一个Linker。这样的异质双官能团分子使其具有较大的分子量。化学家们不断探索新的策略来降低分子量，使PROTAC更“类药”。
分子胶与PROTAC相比，被认为是一种更“致密的分子”，它们也可以像PROTAC一样触发三元复合物的形成。由于这些原因，分子胶比PROTAC具有更好的类药特性[9]。



图5. 分子胶和PROTAC作用机制比较[3]

参考文献：
[1] Balint Földesi, Paul Domanski. Recycling the Cell: Autophagy and the Ubiquitin-Proteasome Processes.biomol-blog, 2019.
[2] Churcher I .Protac-induced Protein Degradation in Drug Discovery: Breaking the Rules - or Just Making New Ones?. Journal of Medicinal Chemistry, 2018, 61(2):444-452.
[3] Maneiro M , Vita E D , Conole D , et al. PROTACs, molecular glues and bifunctionals from bench to bedside: Unlocking the clinical potential of catalytic drugs[J]. Progress in Medicinal Chemistry, 2021.⤵️喜欢我们的内容，欢迎关注 @药明康德DMPK，或者点赞、评论、分享给其他读者吧！

卡卡

药物研发领域一直在不断探索创新的方法来治疗疾病，而靶向蛋白降解剂（Targeted Protein Degraders）如 分子胶（Molecular Glue）和  PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras）是近年来备受关注的革命性药物开发策略。这些策略不仅改变了传统的蛋白质药物研发方式，还为治疗各种疾病提供了新的机会。
首先我们来了解一下 靶向蛋白降解剂的概念。
蛋白质降解 是指蛋白质在细胞内被分解成多肽和氨基酸或被完全破坏的过程。
靶向蛋白降解剂 则是一类能够促使特定蛋白质在细胞内被降解的药物或化合物。这种降解通常是通过细胞自身的降解系统（如 泛素-蛋白酶体途径）实现的。
<hr/>这里补充一个知识点，什么是 泛素-蛋白酶体途径？
生物体内蛋白质降解主要是通过 自噬（Autophagy）和 泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）两种途径。
自噬 是通过溶酶体机制将受损的细胞器、错误折叠的蛋白及其他大分子物质等运送至溶酶体降解并再利用的进化保守过程。
（关于自噬，这里我们不做多的介绍，感兴趣的读者可以留言，我们可以后面专门出一期内容来介绍下自噬）



Li F, et al. Oncol Rep. 2019 Nov;42(5):1647-1655.

而 泛素-蛋白酶体系统（UPS）则负责特异性地降解80%以上的细胞内蛋白，是一种高效的蛋白降解途径，对于调控和维护细胞内蛋白质的稳定性和代谢至关重要。

泛素-蛋白酶体系统包括以下几个关键组成部分：
泛素（Ubiquitin）：泛素是一种多肽，通常由76个氨基酸组成，具有与目标蛋白质特异性结合的能力。泛素通过共价连接到目标蛋白质的特定赖氨酸残基上，形成泛素-目标蛋白质复合物。蛋白质一旦被泛素标记上，就会被送到细胞内的“垃圾处理厂”——蛋白酶体进行降解。
E1酶（Ubiquitin-activating Enzyme）：E1酶是泛素-蛋白酶体系统的启动酶，它通过激活泛素分子，将其连接到ATP上形成泛素-AMP中间体，然后将泛素从泛素-AMP中间体转移到E2酶上。这个激活和传递过程是泛素标记蛋白质的第一步。
E2酶（Ubiquitin-conjugating Enzyme）：E2酶是泛素-蛋白酶体系统中的中间步骤，它接收从E1酶传递过来的泛素分子，并将其连接到目标蛋白质上，形成泛素-目标蛋白质复合物的中间体。E2酶通常有多个，每个可能与不同的E3连接酶和目标蛋白质相互作用。
E3酶（ubiquitin ligase）：E3连接酶是泛素-蛋白酶体系统中最关键的成分，负责介导泛素分子与目标蛋白质的特异性连接，从而标记目标蛋白质以进行降解。细胞内存在数百种不同的E3连接酶，不同的E3连接酶具有不同的特异性，决定了泛素分子与哪些目标蛋白质结合。每个E3连接酶都能够调控不同的目标蛋白质的泛素化和降解。
泛素-目标蛋白质复合物：一旦目标蛋白质上附着了足够数量的泛素分子，它就会被标记为待降解的废物。泛素-目标蛋白质复合物的形成允许目标蛋白质被蛋白酶体系统特异性地识别和处理。
蛋白酶体（Proteasome）：蛋白酶体是泛素-蛋白酶体系统中的最后一个环节。它是一个大分子复合物，通常是一个圆柱形的结构，由多个亚基组成。负责将已被泛素标记的蛋白质废物降解成小的肽段和氨基酸，这个过程是高度特异性的，只有被泛素标记的蛋白质才会被蛋白酶体识别和降解，而其他未被标记的蛋白质则不受影响。



Bachiller, S. et al. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 6429.

总的来说，泛素介导的蛋白质降解机制是一个高度特异性的、能耗的过程。它涉及到泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3的连续作用，这些酶相互配合，将多个泛素分子共价连接到目标蛋白质上。最后，被泛素标记的蛋白质会被26S蛋白酶体特异性地识别并降解为小肽段。
泛素本身在去泛素连接酶的作用下得以回收和再利用，而这些小肽段则会在细胞质中被其他蛋白酶降解为氨基酸。降解后的小肽段和氨基酸可以被细胞再次利用，用于合成新的蛋白质或维持细胞的生命活动。



Schematic diagram of the ubiquitination system. Created by Roger B. Dodd

通过这一机制，细胞能够精确地调控蛋白质的稳定性和代谢。这一发现的重要性不仅对于生物学的理解，还在药物研发和治疗疾病方面具有深远的影响。
<hr/>在20世纪七八十年代，以色列科学家 Aaron Ciechanover 和 Avram Hershko，以及美国科学家 Irwin Rose，经过多年的精细研究工作，首次揭示了泛素介导的蛋白质降解机制。他们的研究使我们更深入地了解了细胞如何通过泛素标记不需要的蛋白质，并将其送入蛋白酶体进行降解。
这一重大发现使得 Aaron Ciechanover 和 Avram Hershko 以及 Irwin Rose 于2004年获得了诺贝尔化学奖，以表彰他们对细胞生物学和生物化学的杰出贡献。



以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose (从左至右)

对泛素介导的蛋白质降解的理解为药物研发提供了新的方向和机会。一些药物已经利用了这一机制来调控特定蛋白质的稳定性，用于治疗癌症等疾病。
例如：蛋白质酶体抑制剂（Proteasome Inhibitors）如 Bortezomib 和 Carfilzomib，它们用于治疗多发性骨髓瘤等白血病和淋巴瘤类型的癌症。一些IMiDs（免疫调节药物，Immunomodulatory Drugs），如 来那度胺（Lenalidomide）和 沙利度胺（Thalidomide），已被用于治疗多发性骨髓瘤和淋巴瘤。
总的来说，靶向蛋白降解（TPD）技术是一种特异性的方法，通过细胞内固有的蛋白质降解途径直接识别和降解靶蛋白。
目前，TPD领域已经发展出了多种技术，包括 PROTAC、分子胶、降解标签、溶酶体靶向嵌合体、自噬小体绑定化合物等，这些技术的出现大大扩展了可以被降解的靶蛋白的范围，为药物研发和生物学研究提供了强大的工具。
<hr/>接下来我们就来重点介绍一下 PROTAC 和 分子胶。
蛋白降解靶向嵌合体 PROTAC
PROTAC（Proteolysis Targeting Chimeras）是通过 泛素-蛋白酶体系统 诱导靶向蛋白降解的一种特殊类型。它是一种分子工具，通过促使目标蛋白质被泛素标记并送入蛋白酶体进行降解，从而实现对蛋白质的精确调控。
PROTAC 分子由三个部分组成，分别是：
靶蛋白配体（与目标蛋白质结合的小分子，主要用于靶向和捕获目标蛋白）；
E3泛素连接酶配体（与泛素连接酶结合的小分子，负责特异性招募E3泛素连接酶）；
连接子Linker（前两者之间的连接部分，用于结合两个配体，形成稳定的三元复合物）。


因此，PROTAC 本质上是由两个不同的小分子组成的融合物，一个部分高亲和力地结合到目标蛋白质上，另一个部分结合到泛素连接酶（E3酶）上。
PROTAC 的存在促使目标蛋白质与E3酶结合，导致目标蛋白质被泛素标记。一旦目标蛋白质被标记为待降解的废物，它将被26S蛋白酶体系统特异性地识别和降解，最终转化为小肽片段和氨基酸。



Garber, K. Nat Biotechnol 40, 12–16 (2022).

在人类基因组中已经发现了600 多个E3 连接酶，但是其中只有少数被用于 Protac 设计。目前用于开发小分子 Protac 药物的E3 连接酶，主要是 MDM2、IAPs、VHL、CRBN、DCAF 和 RNF 等，它们各有优缺点。
陶术生物：
蛋白降解靶向联合体 | PROTAC |陶术生物

• E3 连接酶的配体，都可以为您提供。
  

2. 可以提供多种 E3 连接酶配体 与 连接子 的二元复合物，以便与靶蛋白配体快速合成得到最终Protac 分子。
3. 还可以提供配体（如Thalidomide/Pomalidomide）的衍生砌块化合物，以便于优化配体结构。


<hr/>分子胶
“分子胶”(Molecular glues) 是一种用于蛋白质调控的药物或小分子，其作用机制是通过增强蛋白质之间的相互作用来调节蛋白质的功能和代谢。
与传统的酶抑制剂或受体激动剂不同，分子胶的主要功能是通过促使蛋白质之间的结合，改变它们的构象或功能，从而影响细胞信号传导和代谢过程。
因此，从广义上来说，那些能够将两个蛋白质相互黏附在一起的小分子都可以被理解为 分子胶 。


分子胶 的应用范围非常广泛，也可以作为靶向蛋白降解剂的一种特定类型。它可以通过影响目标蛋白质与E3泛素连接酶之间的相互作用，调控蛋白质的泛素化和降解。


在靶向蛋白降解(TPD)领域，分子胶 通常是一种单价小分子(<500Da)，能通过重塑E3连接酶受体的表面促进目标蛋白（Protein of interest）的募集，进而推动目标蛋白的泛素化，随后被蛋白酶体降解。



https://www.tocris.com/product-type/molecular-glues#background

目前 已获批在临床应用的 分子胶 主要是免疫调节剂，例如：
Thalidomide 沙利度胺，能够抑制 cereblon，即 cullin-4 E3 泛素连接酶复合物 CUL4-RBX1-DDB1 的一部分，具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤作用。它可以作为分子胶来增强底物；
Thalidomide | Autophagy | TNF | Ligand for E3 Ligase | Molecular Glues | Apoptosis | TargetMol


Thalidomide, CAS 50-35-1

Lenalidomide 来那度胺，是沙立度胺的衍生物，也是具有口服活性免疫调节剂，以分子胶的方式作用。是泛素 E3 连接酶 cereblon (CRBN) 的配体，可通过 CRBN-CRL4 泛素连接酶对淋巴转录因子 IKZF1 和 IKZF3 进行选择性泛素化和降解。
Lenalidomide | Ligand for E3 Ligase | Molecular Glues | Apoptosis | TNF | TargetMol


Lenalidomide, CAS 191732-72-6

Pomalidomide 泊马度胺，是一种抗血管生成剂和免疫调节剂，以分子胶的方式作用。与 E3 连接酶 cereblon 相互作用，诱导必需的 Ikaros 转录因子的降解。
Pomalidomide | Apoptosis | Ligand for E3 Ligase | Molecular Glues | TNF | TargetMol


Pomalidomide, CAS 19171-19-8

<hr/>“分子胶”与 PROTAC 的优势和区别
虽然 分子胶 也是通过泛素-蛋白酶体系统招募蛋白质进行降解，然而，与 PROTAC 也存在一些不同之处：
从结构上比较，
分子胶 是单功能小分子化合物，不包括两个不同的功能域；而 PROTAC 是双功能小分子化合物，通常由两个功能域组成，一个部分用于结合目标蛋白质，另一个部分用于结合泛素连接酶（E3 ligase）。
因此，分子胶 体积通常更小，常常能符合Lipinski五规则，预计具有比 PROTAC 更好的药理学性质、更高的膜通透性、更好的细胞摄取和更好的血脑屏障穿透能力。


从作用机制上说，
分子胶 通常是通过与目标蛋白质和/或其他蛋白质之间的非共价相互作用，改变蛋白质的构象或稳定性，从而影响其功能和代谢。PROTAC 则是通过促使目标蛋白质与E3连接酶结合，将目标蛋白质标记为待降解的废物，被泛素标记并送入蛋白酶体进行降解。
从作用结果上来说，
分子胶 可以用于调控特定蛋白质的相互作用，而不一定涉及降解。它们可能通过增强蛋白质之间的相互作用来改变信号传导通路或调整蛋白质功能。PROTAC 是一种更加直接的蛋白质降解方法，通过改变目标蛋白质的命运，将其定向降解。
从药物发现的角度上看，
分子胶 的发现存在偶然性，PROTAC 通常具有更精确的设计，以确保它与目标蛋白质和E3连接酶之间的相互作用特异性和高效性。
通过对比可以发现，分子胶 是一个更广泛的概念，与 PAOTAC 存在区别但是又有一定的相似之处。甚至 从某种程度上来说，PROTAC可以被视为一种具有特定功能的分子胶。
总的来说，分子胶 和PROTAC 都极大地扩展了可成药靶点的范围；有利于减少药物由于脱靶造成的副作用；并且可以克服抑制剂药物由靶蛋白表达增高和变异引起的抗药性；能够有效清除靶蛋白，通过消除其活性而增加药效。
<hr/>靶向蛋白降解剂的开发
目前 分子胶 的设计原理尚不明晰，新型分子胶的发现方法很大程度上还依赖于大量高通量筛选以及系统验证工作。
分子胶 在初步发现后，后续需要继续进行骨架优化和验证。还需要高效、合理的设计策略来促进更有效的新型化合物开发，并评估其在不同适应症中的活性。 要从偶然发现发展为合理设计，我们还需要能够模拟和预测分子胶结合的计算工具以及结晶方面的进步，从而增进对蛋白质对接的理解。相信未来，分子胶 及PROTAC 会在药物研发领域有更多的应用，取得更多的突破。


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