一文读懂酶联免疫吸附实验（ELISA）

千姿百态

酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是将抗原或抗体结合在固相载体表面，利用抗原抗体的特异性结合以及抗体或者抗原上标记的酶催化特定底物发生显色反应，实现目标物检测的免疫分析方法，可测至皮摩尔（pmol）级别。
技术原理
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。（1）将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。（2）测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。（3）用洗涤的方法分离抗原-抗体复合物和游离成分。（4）加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量。



图1：ELISA原理图

试剂
❆固相的抗原或抗体
❆ 酶标记的抗原或抗
❆ 酶作用的底物。
ELISA常见类型
直接法：
将抗原按一定的比例稀释好包被到固相载体上，然后加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。



图2：直接法

特点
适用于检测小分子抗原，优势：实验步骤少，检测速度快，无须使用二抗可避免交互反应，结果较准确。缺点：每种靶蛋白都需要准备能够与其特异性结合的一抗，实验灵活性低，灵敏度低。
间接法：
将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原一待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。



图3：间接法

特点
常用于抗体的检测，只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗体检测各种与抗原相应的抗体。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它多的免疫反应性。缺点：可能会发生交叉反应，与直接法比，实验周期长。
夹心法：
类型：分为直接夹心和间接夹心。检测抗体是酶标抗体，则可称为直接夹心ELISA；检测抗体不带有标记，则还需要使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA。
直接夹心又分为双抗体夹心和双抗原夹心。夹心ELISA实验需要用到配对抗体（捕获抗体和检测抗体），原理：将捕获抗体结合到ELISA板上，通过捕获抗体固定抗原，随后通过直接或间接ELISA的方式进行检测。在夹心ELISA实验中，最重要的是对配对抗体进行验证，确保配对抗体能同时与抗原结合，以确保实验的顺利进行。



图4:夹心法

特点
常用于抗原测定，适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原。优点：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。
竞争法：
首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可。



图5：竞争法

特点
常测定小分子抗原：如激素和药物之类，也可以用来检测大分子抗原物质甚至是抗体。检测大分子抗原物质时，由于空间位阻的影响，使得该检测方法没有双抗体夹心法检测大分子抗原物质灵敏度高。优势：可适用不纯的样本，快速高效。 缺点：整体的敏感性和专一性都较差。
ELISA应用
❆常规临床诊断应用
抗原及其抗体检测,特种蛋白的检测,非肽类激素的检测,血液中药物浓度的检测 。
❆食品安全检测
检测食品中的重金属,农药残留,生物毒素等。
❆畜牧养殖中疫病
饲料中农药、霉菌毒素等有毒有害物质的残留以及畜禽产品中药物残留检测，畜禽养殖中疫病诊断。
参考文献
[1] 刘国永,石宇,孙健,穆婧.基于荧光体系的酶联免疫吸附分析法的研究进展[J/OL].分析化:1-12[2023-03-31].DOI:10.19756/j.issn.0253-3 82 0 . 2 21449.
[2] 王天义,胡冰冰.酶联免疫吸附检测法临床应用进展[J].中国疗养医学,2022,31(04):368-370.DOI:10.13517/j.cnki.ccm.2022.04.007.
[3] 胡子聪,刘香云,董华,于阿立,周灵蝶,房翠兰.酶联免疫吸附反应在食品安全检测中的应用研究进展[J].粮油与饲料科技,2022(03):23-27.
[4] 贾丽萍.ELISA技术在畜牧养殖业中的应用进展[J].中国动物保健,2020,22(12):65-66.

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