分子生物学实验—核酸提取（磁珠法）

wolf

随着疫情相关信息的传播，许多先前不为大众所知的诊断行业专业名词逐渐变得家喻户晓，如核酸检测、试剂盒、咽拭子、假阴性等等。我们在进行核酸检测的时候，通常需要在检测之前经历核酸提取这一步骤，简单来说就是将病毒的核酸从我们采集的样本当中提取出来，以用于后续实验。
通过对磁珠进行一定的包被（如硅基、氨基、羧基等），从而可以实现对核酸的高通量、自动化提取，这一技术产生于20世纪80年代，已经有了成熟的试剂盒并形成为产业。


核酸提取法基本原理：
首先，磁珠是一类特殊的纳微米材料，它们的尺寸通常在零点几微米到几微米之间，仅为一根头发丝直径的十几分之一到几十分之一，肉眼是无法观测到单个磁珠的。
其次，它们具有超顺磁性，在磁场中可以向一侧迅速移动，聚集在一起，而去除磁场后又能够迅速恢复到分散状态。
最后，用于核酸提取的磁珠表面具有特定的性质，在某些条件下能够将病毒核酸吸附在表面，在另一些条件下又能将病毒核酸从表面释放下来，用于后续的检测步骤。核酸结合到磁珠上主要依靠静电作用、疏水作用和氢键作用。细胞或组织在裂解液作用下，其中的DNA/RNA被释放出来。此时经过表面修饰的超顺磁性氧化硅纳米磁珠即与核酸进行“特异性结合”，形成“核酸-磁珠复合物”。然后在外加磁场的作用下，复合物即分离出来。最后经过洗脱液洗去非特异性吸附的杂志、去盐、纯化后，即得到欲提取的核酸物质。


传统核酸提取法和磁珠法比较：

传统核酸提取法	磁珠法
技术简单	高质量、高通量
手工提取	自动化流程
操作繁琐、费时费力	免去了复杂的人工提取
不适合大量样品核酸提取	减少酚类、氯仿等有机试剂对操作人员伤害
不适合临床分子诊断	极大满足如今对核酸提取效率的需求

随着基因检测、个性化给药、产前诊断等的普及，在生物行业各领域都追求高通量、自动化的今天，传统DNA提取方法的局限愈来愈明显，而磁珠法DNA提取的优势则愈来愈明显：能够实现自动化、大批量操作；操作简单、用时短；不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，安全无毒完全符合现代环保理念；与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。
如何评估磁珠法提取核酸的效果？
这里给出三个评价尺度：
Purity（纯度），具体而言就是磁珠提取后的核酸中含有多少非核酸类的杂质残留，如蛋白、盐、多糖等。该指标通常用吸光度比值（A260/A280和A260/A230）来衡量。
Q指的是Quality（质量），磁珠提取后的核酸尤其是较长的基因组核酸应保持其完整性，不应出现断裂或降解等现象。该指标可通过简单的凝胶电泳或者复杂一些的特定PCR及微流控芯片（如Agilent Bioanalyzer）进行评估。
R指的是Recovery（收率），磁珠提取过程应当尽量将所有的核酸都能从样本中提取出来。高收率对于核酸检测尤其是疾病早期检测的灵敏度至关重要，在疾病早期，样本中的病原体核酸含量通常较低，如果不能高效率地提取到所有核酸，那么很容易出现假阴性，导致漏检。
磁珠如何与核酸结合实现提取功能？：
核酸作为一种生物大分子，之所以能够在水溶液中稳定分散不沉淀，是由于三种非共价作用力的存在：（1）静电相互作用（2）范德华力（3）氢键。核酸分子具有多个磷酸基团，呈现高度负电性，分子间互相排斥从而避免发生团聚。此外，核酸分子在水溶液中通过氢键与范德华力结合了大量的水分子在其周围，形成一个水化层，也阻止了分子间的聚集。因此，要使得核酸分子结合到磁珠表面，就必须削弱上述作用力，屏蔽溶液中的静电斥力，同时破坏核酸分子表面的水化层，使其能够与磁珠表面相接触，进而产生吸附。


目前根据磁珠的表面性质，磁珠大致有以下几类：
1. 硅羟基磁珠：
这是一类使用最为广泛的磁珠。使用硅羟基磁珠提取核酸时，通常需要高浓度的离液盐（NaI、NaClO4、GuHCl、GuSCN等）。高浓度的盐离子能够有效屏蔽溶液中的静电斥力。同时，离液盐离子还能竞争性地与磁珠表面以及核酸分子相结合，破坏二者表面原有的水化层，促进磁珠表面与核酸分子的吸附（氢键+范德华力）。由于常用的离液盐如胍基离子对PCR有抑制作用，因此它们必须在后续的洗涤步骤中被去除，去除效果可通过吸光度比值进行监控。
2. 羧基磁珠：
这类磁珠除了能够像硅羟基磁珠一样在高浓度离液盐环境中结合核酸分子之外，还能通过另一种特殊的机制与核酸分子结合。通过向溶液中加入一定浓度的PEG和NaCl，可以使得核酸分子从伸展的构象逐渐蜷缩成小球状，其上的负电荷也大部分被屏蔽掉，促使核酸分子吸附到磁珠上。核酸分子的分子量越大，越倾向于发生这种从伸展线团向蜷缩小球的构象变化，因此，通过调节盐溶液与核酸样本的体积比，能够实现较大分子量的核酸片段在羧基磁珠表面的优先吸附，达到所谓的片段筛选效应。
3. 氨基/咪唑基等正电荷磁珠：
此类磁珠能够方便地通过调节pH实现核酸分子在表面的可逆结合。不过，由于正电荷表面对核酸分子吸附过强，容易导致收率偏低，因此正电荷磁珠的使用反而不如硅羟基及羧基磁珠广泛。
比克曼生物深孔板：
用于样本储存以及核酸提取
无热原，无酶
符合国际标准尺寸，适用于自动化工作站
可高温高压灭菌
Rcf：3000-4000g
比克曼生物磁棒套：
配合磁棒实现磁珠的吸附与分离，进行核酸提取
进行样品的混合、裂解等



原文地址：https://zhuanlan.zhihu.com/p/544495534