血清淀粉样蛋白A在寻常型银屑病皮损组织中的表达

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摘要：目的 探讨血清淀粉样蛋白 A（SAA）在寻常型银屑病皮损组织中的表达及其意义。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real－time PCR）、免疫组化技术检测 11 例寻常型银屑病患者皮损组织及皮损周围组织、8例非银屑病患者的正常皮肤组织中 SAA 在 mRNA 和蛋白不同水平的表达情况。 结果 Real－time PCR检测结果显示，银屑病皮损区 SAA mRNA 水平明显高于皮损周围组、正常对照组，差异有统计学意义（P＜0．05）。免疫组化显示 3组皮损组织均有 SAA 蛋白表达，且寻常型银屑病组表达明显高于皮损周围组、正常对照组，差异有统计学意义（P ＜0．05）。
结论 寻常型银屑病皮损组织中 SAA 在基因及蛋白水平表达均升高，提示 SAA可能与寻常型银屑病的发生发展有关联。血清淀粉样蛋白 A （Serum amyloid A, SAA）是一种组织淀粉样蛋白 A的前体物质，属于急性期反应蛋白[1]。目前，在细菌、病毒感染、动脉粥样硬化、冠心病、急性移植排斥反应、肿瘤等疾病中均检测到血清 SAA升高[2]。IL-23/Th17 通路是银屑病发病的核心机制，近期研究发现，SAA 在 IL-23/Th17通路的活化过程中发挥一定作用[3-4]。本研究采用实时荧光定量 PCR（Real-time PCR）和免疫组化法检测SAA在寻常型银屑病皮损表达分布差异的变化。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2013 年 10 月—2014 年 8 月，在上海市皮肤病医院经临床及病理证实的寻常型银屑病患者 11 例，其中男6 例，女 5 例。采用银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分，总评分 PASI≥ 10 及皮损面积>10％的中、重度寻常型银屑病患者。对照组织标本来自外科手术躯干或四肢部位的正常组织（8 例）。将标本分 2 部分，各约 50mg 组织，分别放入标记好的冻存管立即液氮速冻，-80 冰箱保存，用于 Real-time PCR 检测；另一部分用4％甲醛固定，常规石蜡包埋，用于免疫组化。
1.2 主要试剂 SAA 兔抗人多克隆抗体为英国Abcam公司产品；过氧化物酶标记羊抗兔抗体、二氨基联苯胺（DAB）酶底物显色试剂盒为武汉博士德生物技术有限公司产品。Real-time PCR试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品。
1.3 方法
1.3.1 Real-time PCR 法检测 SAA 的表达 冻存组织研磨后用应用相关试剂提取总 RNA；紫外分光光度计测定 RNA浓度和纯度。RNA 经逆转录生成cDNA 后，进行实时荧光定量 PCR 检测。引物设计合成 SAA表达所需的引物序列上游为：5’-CGAAGC TTC TTT TCG TTC CTT-3’，下游为 5’-CACCAT GGC CAAAGA ATC TC-3’；内参 GAPDH 上游5’-GGT CGG AGT CAA CGG ATT TG-3’; 下游5’-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3’。选用两管反应体系对目的基因和内参照进行扩增，建立总体积为 20μL 的逆转录反应体系。取 2 μL cDNA 进行PCR 扩增，扩增条件：94预变性 30 s，95 变性5 s，58 退火34 s，60 延伸 1 min，共进行 40 个循环，循环结束后 60 延伸 10 min，4 保存。
1.3.2 免疫组化 石蜡标本切片脱蜡水化；0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液高温高压修复 2 min，室温自然冷却；3％H2O2室温避光孵育 10 min；滴加 SAA 一抗，4 湿盒孵育过夜；次日，再滴加二抗，室温孵育30 min 后 DAB显色，苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。上述各步骤之间均以磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗 3次。每次实验均设立一个阴性对照，即 PBS 代替一抗，其余步骤相同，阴性对照DAB 不能使其显色。所有组织染色条件相同。
1.3.3 免疫组化染色结果判定 光镜下观察，表现为棕黄色颗粒即 SAA 表达阳性，着色强度高于背景非特异性染色。由 2位有经验的病理科医生采用双盲法观察每张切片，随机选取 5个不重叠的高倍镜视野（×400），按染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定。按染色强度评分：无着色计 0 分，淡黄色（弱）计 1分，浅棕色（中）计 2 分，深棕色（强）计 3分；按阳性细胞所占比例评分：< 5％计 0 分，5％～25％计 1分，26％～50％计 2 分，51％～75％计 3 分，>75％计 4 分，2 种评分相加，≤3 分判为阴性（-），>3分为阳性（+）。
1.4 统计学分析 采用 SPSS 22.0 软件进行统计学处理。对寻常型银屑病皮损、非皮损以及正常皮肤组织 SAA 与 GAPDH比值进行单因素方差分析，实验结果以 x±s 表示；采用卡方检验比较 SAA 蛋白表达阳性率。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SAA mRNA 表达水平 Real-time PCR 实验结果显示寻常型银屑病皮损组织 mRNA表达强度明显高于正常组织（7.15±2.93 vs. 2.36±1.49，P<0.05）；寻常型银屑病皮损组织表达高于皮损周围组织（7.15±2.93 vs.3.23±2.00，P<0.05）；而皮损周围组与 正常对照组间差异无统计学意义 （3.23±2.00 vs.2.36±1.49，P>0.05），见图 1。

2.2 免疫组化染色观察 正常皮肤中 SAA 染色主要位于表皮层的基底细胞层。在寻常型银屑病皮损中 SAA染色阳性细胞弥漫分布于表皮层的棘细胞层，真皮乳头处单个核细胞也有表达。而 SAA在病变周围组织亦表达于表皮层的基底细胞层，与正常对照组表达相近，见图 2。

2.3 SAA 蛋白表达情况 SAA 在寻常型银屑病皮损组织中表达的阳性率为90.9％（10/11），高于皮损周围组（18.2％，2/11，χ2=11.73，P<0.01）和正常对照组（12.5％，1/8，χ2=11.68，P<0.01），而正常对照组与皮损周围组比较差异无统计学意义（χ2=0.11，P=0.73）。

3 讨论
急性期反应的重要特征是急性期蛋白的诱导表达且表达水平快速升高。常见的急性期蛋白包括SAA 和 C 反应蛋白（C-reactiveprotein,CRP）[1]。在血管粥样硬化、类风湿性关节炎和炎症性肠病等许多炎症性疾病中，急性期蛋白已经成为一个重要的临床标记物。同时，急性期蛋白还参与调节天然免疫和适应性免疫反应。在小鼠哮喘模型中，SAA能够促进 Th17 细胞的分化维持[5] 。在外周血单核细胞中，SAA 还可诱导外周血单核细胞分泌 IL-23[6]，而IL-23恰恰是 Th17 细胞分化和表型维持的关键细胞因子。此外，一项近期的研究显示：SAA 可以通过Notch1信号通路，促进银屑病皮损部位真皮血管新生[7]。以上研究均提示，SAA 可能在银屑病的发病过程中发挥一定作用。
IL-23/Th17 轴失衡是银屑病发病机制中公认的经典理论。银屑病的 IL-23/Th17 轴从概念上可分为 3个阶段：第一阶段真皮树突状细胞持续表达IL-23，维持 Th17 细胞持续活化并释放其特征性细胞因子 IL-17 和IL-22；第二阶段 IL-17 和IL-22作用于表皮角质形成细胞，诱导角质形成细胞过度增殖、活化；第三阶段活化的角质形成细胞分泌炎症细胞因子、趋化因子及抗菌肽，吸引并作用于真皮T 淋巴细胞和树突状细胞等，正反馈放大炎症反应，触发并维持银屑病进程。
本研究通过 Real-time PCR 和免疫组化等方法表明，SAA在寻常型银屑病皮损中，尤其是表皮角质形成的细胞中过度表达，与正常对照组间差异有统计学意义，提示 SAA可能不仅是一种存在于循环中的急性期蛋白，而且是一种重要的局部炎症介质。尽管以往的研究报道循环中的 SAA主要来源于肝细胞，在多种组织器官中都可以检测出 SAA的表达，包括动脉粥样硬化的斑块区、阿尔兹海默症患者脑组织以及类风湿性关节炎滑膜组织。笔者的观察扩展了以往的研究，证实银屑病患者皮损可能是另一种重要的SAA 来源。银屑病表皮角质形成细胞产生的 SAA可能通过旁分泌的形式作用于真皮内的免疫活性细胞以及血管内皮细胞，导至银屑病正反馈加重。
综上所述，SAA 在寻常型银屑病皮损组织中表达明显增强，提示 SAA 在寻常型银屑病发生发展过程中可能发挥重要作用。但 SAA对表皮角质形成细胞以及真皮免疫活性细胞的生物学效应，仍需深入研究。