如何确定pcr退火温度？以及程序设计？

长长的路

PCR一般包括三个步骤:变性，退火，延伸。其中，退火过程中温度是非常重要的一个参数，温度过高会导致产量降低、甚至得不到产物，温度过低又会导致非特异扩增。
退火温度设计的一个重要参数是熔解温度(Tm)。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm值计算常见公式：在引物长度小于20bp时：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃；在引物长度大于20bp时：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃。另外还可以通过寻找文献推荐，调整引物序列，调整反应体系，调整酶种类，计算得到Tm值。对于进行PCR试验而言，最优的引物Tm值一般在55-65℃之间。
获得引物的Tm值只是寻找最适退火温度的起始，而梯度PCR则是寻找最佳退火温度最简便的方式。利用梯度PCR仪，通过现有的引物熔解温度(Tm)设置温度区间。将退火温度设定为比最低的Tm 低5℃，以2℃为增量设置梯度温度筛选最适退火温度。
同样也可以通过瑞沃德梯度PCR仪自带的Ta值计算功能，将引物对的碱基序列直接输入，即可获得Ta值，将计算结果中的 Ta 值写入到步骤设置温度梯度界面的中值字段中，获得一组梯度温度进行最适退火温度筛选。