前言 液体活检在癌症早期筛查中前景广阔，如循环肿瘤DNA (ctDNA)、cfRNA、蛋白质和自身抗体。现有的循环肿瘤DNA检测已通过整合表观遗传学信息（如甲基化、片段化模式）来提升性能，而RNA的转录后化学修饰，即表观转录组信息，可能为发现生物标志物提供新来源。但作为一个丰富但尚未充分利用的生物标志物来源，由于检测技术繁琐，其临床应用面临障碍。 近日， 来自德国蜂鸟诊断公司的研究团队在杂志communications medicine上发表了一篇题为“Nanopore based RNA methylation profiling of a circulating lung cancer biomarker”的文章。本研究旨在利用纳米孔等第三代测序技术，开发一种能够对单个天然RNA分子进行直接测序、同时获取序列和化学修饰信息的方法。利用这一方法，作者揭示了肺癌患者血浆中28S4014-4035片段呈现完全双甲基化（GmCm）模式的比例显著升高，GC、GmC和GCm甲基化模式也相应显著减少。分析结果显示，GmCm甲基化比例是独立于年龄、性别和吸烟史等临床因素的肺癌诊断预测因子，诊断分类器的ROC为0.84，显示出作为肺癌诊断生物标志物的巨大潜力。 图片来源：Communications medicine 主要内容 牛津纳米孔平台上的小RNA测序策略 核糖体RNA （rRNA）是一个很有前途的表转录组学信息来源，rRNA片段（rRF）以非随机的方式产生，具有重要的功能，可以作为癌症的小RNA生物标志物。作者重点研究了一个特定的22 nt肺癌rRF （28S4014-4035）的特征，可以在两个位点G7和C19被2 ' -O-甲基化（Nm）修饰，旨在开发一种2′-O-甲基化状态分析的技术，并评估其在血液诊断中的价值。 研究人员设计了一种针对性的捕获策略，通过连接经过结构优化的dumbell Oligo 5’adapter，以及Oligo AB 3’adapter，将这个约22nt的超小RNA片段构建成兼容于牛津纳米孔平台（ONT DRS）的文库（下图b）。这是迄今为止在该平台上成功测序的最短的RNA分子。
牛津纳米孔平台上的小RNA测序策略。图片来源：Communications medicine 小RNA甲基化状态和AI分类模型 22 nt rRF 28S4014-4035在G7和C19位置含有两个Nm修饰位点，因此存在四种不同的形式GC（未甲基化）、GmC （G7甲基化）、GCm （C19甲基化）和GmCm（双甲基化）。利用纳米孔原始离子电流信号，作者训练了基于ResNet架构的一维深度学习模型，能够对单个分子的甲基化状态和测序文库中的条形码进行高精度分类。结果显示，小RNA甲基化和条形码状态模型的测试集准确率分别为92%和95%（图c， d），并且预测与真实的GmCm甲基化分数之间存在很强的相关性（Pearson r = 0.9971）。
小RNA甲基化状态的AI分类模型。图片来源：Communications medicine 生物样品中小RNA修饰的检测 在HCC-827细胞模型实验中，作者使用该方法成功检测到了条件培养基中28S4014-4035片段的甲基化状态，G7位置的Nm修饰频率为60.4%， C19位置的Nm修饰频率为84.6%（图b）。并且对应的snoRNA基因（SNORD102和SNORD75）被敲除后，G7和C19位置的Nm显著下降。 细胞模型中的小RNA甲基化检测。图片来源：Communications medicine 在临床样品中检测小RNA修饰并用作癌症诊断 研究者还将该方法应用于一个包含43名疑似肺癌患者的临床队列的血浆样本中。结果显示，与健康对照相比，肺癌患者血浆中28S4014-4035片段呈现完全双甲基化（GmCm）模式的比例显著升高，GC、GmC和GCm甲基化模式也相应显著减少（图c）。这种甲基化模式的改变即使在早期（I期和II期）肺癌患者中也能观察到。 逻辑回归模型分析显示，GmCm甲基化比例是独立于年龄、性别和吸烟史等临床因素的肺癌诊断预测因子。且GmCm甲基化比例这一指标在该队列中的受试者工作特征曲线下面积为0.84（图d），显示出作为肺癌诊断生物标志物的巨大潜力。
28S4014–4035 甲基化在肺癌患者液体活检样本中的研究。图片来源：Communications medicine 总结与讨论 作者利用纳米孔等第三代测序技术，开发了一种能够对单个天然RNA分子进行直接测序、同时获取序列和化学修饰信息的方法，以探索其作为肺癌诊断新工具的潜力。结果显示，突破了纳米孔直接RNA测序对短RNA分子的技术限制，首次实现了对~22nt RNA片段的单分子、单分辨率甲基化状态分析。 利用这一方法，作者揭示了肺癌患者血浆中28S4014-4035片段呈现完全双甲基化（GmCm）模式的比例显著升高，GC、GmC和GCm甲基化模式也相应显著减少。分析结果显示，GmCm甲基化比例是独立于年龄、性别和吸烟史等临床因素的肺癌诊断预测因子，ROC为0.84，显示出作为肺癌诊断生物标志物的巨大潜力。 |
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