无需扩增，比常规Cas13a/crRNA灵敏度高10000倍？

在传统CRISPR/Cas13a激活反应中，Cas13a内切酶和crRNA形成功能性RNP复合物，结合与crRNA间隔区序列互补的RNA靶标。然而，当目标RNA含有anti-tag序列时，Cas13a RNP的构象变化被抑制，将会阻碍其反式切割活性的激活（图a）。作者设计了一种特殊的发夹结构RNA，称为"CRISPR anti-tag hairpin"。此结构包含anti-tag序列和一个具有不对称长度的DNA和目标RNA双链嵌合区域，其中目标RNA区域与crRNA完全互补（图b）。虽然含有目标RNA序列，但由于发夹结构和anti-tag的存在而无法激活Cas13a；但在目标RNA存在的情况下，Cas13a被激活并启动反式切割反应，导至anti-tag序列被切割，暴露发夹内部的目标RNA序列，使其能够被Cas13a/crRNA复合物识别，进一步激活Cas13a的反式切割活性，从而实现级联信号放大（图c）。

作者在多种反应温度下测试了CARRD体外反式切割实验。结果显示，本实验CRISPR/Cas13a系统在25°C下的反应效率比37°C更高。作者还构建了将anti-tag序列整合到环区中的发夹结构，并比较其反式切割活性。在这种构型中，anti-tag序列被定位在目标RNA的3'和5'末端，分别为‌5'-DNA tag-HP和‌5'-RNA tag-HP‌，结果表明，5'-RNA tag-HP表现出显著降低的信号，表明RNA的3'端环结构对Cas13a的反式切割活性具有显著的抑制作用（图d）。

作者设计了具有不同互补DNA blocker长度(14-, 16-, 18-和20-bp)的CRISPR anti-tag发夹。结果显示，‌14 bp DNA blocker‌为最优长度，可有效阻断HP内的目标RNA序列，环切割后Cas13a能有效识别HP内的目标RNA并进一步诱导反式切割。

在优化条件下，作者研究了HIV RNA的CARRD法检测。结果表明，与不添加14D HP的常规Cas13a/HIV crRNA反应相比，添加HIV 14D HP的CARRD法检测灵敏度显著提高，检出限 （LOD）为10 aM，比常规Cas13a/crRNA反应灵敏度提高了10000倍（图a）。作者还将CARRD检测应用于丙型肝炎病毒(HCV)RNA的检测，优化结果显示，CARRD检测对HCV RNA的检测限也达到了10 aM，验证了CARRD检测的技术通用性。

在HIV检测特异性测试中，HIV RNA靶标观察到强烈的荧光增加，而HCV RNA未增强荧光信号。同样，对于HCV检测，HCV靶标RNA观察到强荧光信号，而HIV RNA未产生显著荧光信号。这些结果证明了CARRD检测的高度特异性（图d）。

作者应用CARRD法分析HIV临床血浆样本，验证其临床可行性。共入组30个临床血浆样本并提取其RNA，RT-qPCR确认9个HIV阳性和21个阴性。将RT-qPCR结果与CARRD检测结果进行比较发现，除样品24和25外，所有结果均吻合（下图 c）。检测的灵敏度为77.8%，特异性为100%，总体准确率为93.3%，阳性预测值（PPV）为100%，阴性预测值（NPV）为91.3%。受试者工作特征(ROC)曲线的AUC为0.9709，表明具有优异的诊断性能（图f）。

在本研究中，作者发现目标RNA中存在的二级结构和anti-tag序列会抑制Cas13a的反式切割活性。通过引入一种特异性的CRISPR anti-tag发夹，作者开发了一种使用CRISPR/Cas13a酶的CRISPR anti-tag介导的室温RNA检测（CARRD），无需预扩增即可进行RNA检测。CARRD方法检测人类免疫缺陷病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV），检测灵敏度为10aM，比常规的Cas13a/crRNA检测灵敏度高10000倍。作者通过检测HIV临床血浆样本验证了其临床可行性，展示了一种简单、经济、高效的病毒RNA检测方法。由于其简单、敏感和灵活的反应温度，CARRD方法有望具有广泛的适用性，为开发现场可部署的诊断工具铺平道路。

但CARRD法仍需改进，以提高该检测在临床应用中的特异性和可靠性。CRISPR anti-tag发夹的设计变化可能导至不一致的结果，需要进一步优化以最小化背景信号。未来的工作可能集中在优化crRNA设计，改进发夹结构或增强单核苷酸识别。总的来说，这项研究促进了对CRISPR/Cas13a的理解，为更容易获得和高效的RNA检测方法奠定了基础，对下一代分子诊断具有重要意义。