在生物学和临床研究中，蛋白质的特异性检测至关重要。传统方法虽发挥了重要作用，但在多重检测能力和灵敏度上存在局限。而近日哈佛大学&中国科学院深圳先进技术研究院联合发表在《Nucleic Acids Research》上的一项研究，为蛋白质原位成像带来了突破性进展。
公司网址：www.lewinbio.com 蛋白成像是研究细胞结构与功能的核心技术。然而传统免疫染色依赖荧光或酶标抗体，受限于以下问题： ▸ 多重成像能力有限（一般只能3-4色） ▸ 灵敏度难以满足低丰度蛋白检测 ▸ 图像易受背景噪声干扰 于是，DNA标记抗体应运而生！通过DNA的程序化设计和扩增能力，科学家实现了“将蛋白可视化”的全新可能。
在本研究中，作者提出了一种全新的DNA偶联抗体染色方案，有效抑制了非特异性信号，性能优于现有公开方法。我们进一步将该方法与杂交链式反应（HCR）结合，开发了信号放大的原位成像流程，并设计出全新的HCR发卡结构，使HCR发卡池从原有的5对扩展至13对，为更高效的多重检测提供了可能。最后，作者在培养细胞和组织切片中验证了该方法的高多重原位成像能力。 技术亮点1： DNA连接抗体+HCR链式反应 = 灵敏&多重 ➣研究团队提出的方案是： 抗体+DNA条形码 ⇩ 启动链式扩增反应（HCR） ⇩ 多重高分辨成像 核心优势： ▸ 将HCR反应对接到抗体标记系统，实现信号的指数级放大 ▸ 原本只有5种HCR对，现拓展到13种，大幅提升多重能力 ▸ 成功在细胞、组织切片、FFPE样本中实现成像
技术亮点2： 有效消除“非特异信号”的难题 ➣长期困扰DNA抗体成像的一大问题是： DNA长链易非特异结合核酸蛋白或核内结构，导至背景信号强烈！ 推测非特异性结合主要源于两方面：一是偶联的DNA寡核苷酸与细胞内核酸等结合；二是带负电的DNA与带正电的细胞分子的静电相互作用。
针对这些原因，本研究中提出优化方案： ▸ 添加互补DNA封闭条形码序列，减少其“误配”潜力 ▸ 使用Dextran Sulfate遮蔽带电相互作用 ▸ 添加适量NaCl提高离子强度 ▸ 可选使用三磷酸钠、多聚dT等其他封闭剂进一步降低背景 ▸ 结果显示，优化方案显著降低背景，同时保留目标蛋白信号，适用于80%以上抗体。
验证成果： 多重成像能力直接拉满！ 杂交链式反应（HCR）是一种原位DNA扩增策略，具有小尺寸DNA发夹的优势，便于穿透组织样本。但以往仅有5对可用，限制了多重检测能力。 研究团队设计并筛选了15对HCR发夹，成功将验证后的HCR发夹库从5对扩展到13对，增加了发夹选择的灵活性和多重检测能力。
成像示例： 在BS-C-1细胞中实现4种目标（Golgi-97、Lamin B、Vimentin、Clathrin）同时检测 在小鼠视网膜切片中实现Bassoon等低丰度蛋白精准成像。
在HeLa细胞中通过3轮HCR成像，实现8重蛋白信号检测！
对比优势与应用前景
应用方向： ▸ 高通量组织病理分析 ▸ 神经环路精细成像 ▸ 多重单细胞表面蛋白检测 ▸ 组织微环境空间组学分析 参考文献： Wang Y, Liu X, Zeng Y, Saka SK, Xie W, Goldaracena I, Kohman RE, Yin P, Church GM. Multiplexed in situ protein imaging using DNA-barcoded antibodies with extended hybridization chain reactions. Nucleic Acids Res. 2024 Aug 27;52(15):e71. doi: 10.1093/nar/gkae592. PMID: 38966983; PMCID: PMC11347153.
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