突破瓶颈！数字液滴检测技术开启multiplexed生物分析新纪元

数字酶联免疫分析（dELISA）凭借超灵敏检测能力，在生物医学领域大放异彩。它能将单个分析物（如核酸、蛋白质、细胞等）分割到数百万个微室中进行计数，在血液等复杂临床样本中实现稳健检测，广泛应用于感染性疾病、心血管疾病、癌症等多种疾病的临床诊断。其检测限（LOD）和定量限（LOQ）较传统ELISA提升约1000倍，还能实现绝对定量。

随着生物标志物研究深入，单一标志物的临床局限性凸显，multiplexed检测需求激增。然而，每一项超灵敏 dELISA 需要约1000万液滴，N项检测就需要N×1000万液滴，传统微流控技术因吞吐量不足，成为制约multiplexed dELISA发展的瓶颈。

• 并行液滴生成与检测：采用76通道并行微流控设计，结合Millipede几何结构，实现液滴生成与检测的大规模并行化，检测视野达350mm²。

• 时域编码激发：用不同最大长度序列（MLS）调制蓝、绿激光，将两种荧光染料的发射信号编码为时间域条形码，通过软件相关分析解码，实现单个微珠双荧光强度的定量测量。

• HDR 成像技术：使用相机对荧光信号进行成像它包含960×720像素，每个像素都转换它在曝光时间内收集的光线被转换为16位数字，值在0到65535之间。在这里面我们的目标是检测叠加的荧光对应于绿色和蓝色染料的强度双编码微珠的身份。借鉴高动态范围摄影原理，调制相机曝光参数，在连续帧中分别捕获 multiplexed 微珠和液滴荧光底物图像，分离微珠定量与液滴信号检测的成像参数。

• 微珠分类精度：对5种双编码微珠（A-E 组）分类准确率超99%，接近流式细胞术（>99.8%），且吞吐量是流式细胞术的10倍以上。

• HRP 检测模型：以链霉亲和素- HRP为模型，成功检测液滴中单个HRP分子，吞吐量达6×10⁶液滴 / 分钟，且底物信号不影响微珠荧光测量。

• 癌症早筛：可同时检测血液中多种肿瘤标志物（如PD-L1+细胞外囊泡），突破单一标志物特异性不足的瓶颈。

• 神经疾病： ultrasensitive检测脑脊液或血液中的Aβ蛋白、神经丝轻链等，助力阿尔茨海默病等神经退行性疾病的早期诊断。

• 细胞异质性分析：结合液滴微流控，对单个细胞或细胞外囊泡进行多重蛋白标记与计数，解析肿瘤细胞亚群功能差异。

• 病毒 / 细菌检测：对单个病毒颗粒（如 HIV）或细菌进行定量，监测感染早期微量病原体。

• POCT场景：基于手机成像的MLS调制检测方案，可开发便携式multiplexed检测设备，适用于资源有限地区的传染病现场筛查。

• 分子诊断：与RCA、TSA等信号放大技术结合，提升无液滴分子荧光检测的通量，推动基因扩增检测技术升级。

• 维度拓展：引入更多荧光染料（如量子点、半导体聚合物点），结合Förster共振能量转移技术，将multiplexed能力从2D拓展至3D，理论可实现9-plex以上检测。

• 算法升级：结合机器学习优化信号解码与分类算法，进一步降低荧光串扰，提升低丰度标志物的检测信噪比。

• 临床转化：开发单锅法multiplexed微珠检测试剂盒，解决抗体交叉反应等问题，推动技术在大规模临床队列研究中的应用。

这项研究为超灵敏multiplexed生物分析提供了全新技术范式，其 “高通量 + 高分辨率” 的双重优势，有望加速精准医学从概念到临床的落地进程。

参考文献：

Atiyas Y, Siedlik MJ, Yang SJ, Issadore DA. Combining time domain modulation optofluidics and high dynamic range imaging for multiplexed, high throughput digital droplet assays. Microsyst Nanoeng. 2025 May 16;11(1):93. doi: 10.1038/s41378-025-00918-2. PMID: 40379646; PMCID: PMC12084528.