术中诊断新技术：中枢神经系统肿瘤快速分子检测

纳米孔测序是一种快速、经济、高效的DNA测序技术，能够在一次分析中获得遗传和表观遗传信息。纳米孔测序的一个特性是可以通过软件实时分析正在测序的DNA分子，动态决定是否继续测序或丢弃某些片段，称为自适应采样。作者开发了一种基于自适应采样的纳米孔测序工作流程Rapid-CNS2，可以在30分钟的术中窗口内提供实时甲基化分类和DNA拷贝数信息，然后在24小时内提供全面的分子谱分析。

Rapid-CNS2使用新鲜或冷冻保存的肿瘤组织在德国和英国的两个中心独立运行，向神经病理学家提供了一份全面的报告，包括质量控制（QC）参数、临床相关的单核苷酸变异（SNV）、小插入和缺失（Indels）、基因融合或结构变异（SVs）、拷贝数变异（CNVs）、MGMT启动子甲基化状态和甲基化分类，以便做出综合诊断。从组织接收到完成诊断样本报告的平均周转时间为2天，而传统工作流程的平均周转时间为20天。

作者将Rapid-CNS2报告的突变分别与常规方法的结果进行了比较。结果显示，对于103个样本，Rapid-CNS2准确地识别了91.67%的NGS鉴定出的SNV。作者进一步专门研究了IDH1/2和BRAF突变，发现48个NGS阳性样本中识别出了47个，没有假阳性（97.9%的灵敏度，100%的特异性）。Rapid-CNS2还确定了MGMT启动子甲基化肿瘤谱之间具有明确差异，251例患者中有227例（90.4%）MGMT启动子状态与MGMT预测相符。使用内置的Rapid-CNS2模型进行甲基化分类，230个样本中有221个（96.1%）样本被正确预测（图d）。

作者还开发了MNP-Flex，一种平台无关的中枢神经系统肿瘤甲基化分类器，包含184个类别（class）。在182个类别中，其中176个类别的F1评分为>0.5，163个类别的F1评分≥0.9。在总共448个样本上测试了MNP-Flex，在德国和英国Rapid-CNS2数据集的甲基化类别水平上分别达到89.1%和78%的准确率，在甲基化家族(family)水平上分别达到98.7%和100%准确率。总的来说，5种不同的技术平台下，MNP-Flex在鉴定甲基化家族方面达到99.6%的准确率，对甲基化类别达到99.2%的准确率，样本可包括冷冻和FFPE样本（下图c）。

为了测试甲基化分类和拷贝数调用的最短时间，作者研究了不同时间点生成的读数。结果发现，35个样本中有29个（83%）具有足够的reads，在测序15分钟后即被分配到正确的甲基化家族。在测序的一个小时内，36个样本中的35个被准确预测。总的来说，此术中方案在样品接收后90分钟内即可获得肿瘤分类和CNV结果，测序和数据解释只需要30分钟或更短的时间，然后于第二天给出SNV、Indels、基因融合和更详细的甲基化分类的综合报告。

下图展示了将Rapid-CNS2与MNP-Flex相结合的工作流程，用于诊断患者ID 220。该样本在测序后30分钟内被Rapid-CNS2甲基化分类器分类为脑膜瘤。24 h测序完成后，作者在CDK6、NOTCH2和TSC2中检测到SNV。此外还观察到染色体的纯合缺失，22q和MGMT启动子未甲基化。这证明了使用MNP-Flex和Rapid-CNS2进行详细分子分析的价值。

作者开发了Rapid-CNS2，一种基于自适应采样的纳米孔测序工作流程。它可以在30分钟的术中窗口内提供实时甲基化分类和DNA拷贝数信息，然后在24小时内提供全面的分子谱分析。作者在多中心环境中验证了Rapid-CNS2，还开发了MNP-Flex，这是一个平台无关的甲基化分类器，包含184个类别。MNP-Flex在全球验证队列中实现了甲基化家族的99.6%准确性和甲基化类别的99.2%准确性。Rapid-CNS2结合MNP-Flex为CNS肿瘤的诊断提供了快速、准确的分子分析平台。这一平台的广泛应用有望促进个性化治疗策略的制定，改善患者的预后。未来，随着技术的不断进步和模型的持续优化，该平台有望在全球范围内得到更广泛的应用。