中低收入地区最好用的诊断技术？

CRISPR相关酶（Cas）如Cas12a和Cas13a也在诊断中应用很广，在大多数诊断情况下，预扩增是必要的。将CRISPR检测与重组酶聚合酶扩增（RPA）等IAT结合是一种经过验证的策略，可以在多步骤工作流程中实施，每个反应在最佳条件下进行，使性能最优。然而，多步骤方法也带来了挑战，如增加工作流程的复杂性，更长的时间，并在样品处理过程中污染的风险更高。单管RPA-CRISPR反应将扩增和检测结合到一个反应中，简化了工作流程并降低了污染风险。然而，它们对提高反应温度的依赖仍然需要专门的设备，这限制了它们在资源有限的环境下的可及性和实用性。

近日，杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Room temperature CRISPR diagnostics for low-resource settings”的文章。作者发现TsCas12a在25°C下是一种高活性的核酸酶，并利用该酶开发了一种单管RPA-Cas12a检测，在室温下检测目标序列可达到阿摩尔水平。使用简单的裂解和检测方法，该方法可以高灵敏度和特异性鉴定了宫颈拭子样本中的HPV-16。此无仪器平台将有助于为中低收入国家开发负担得起的诊断方法。

RPA-Cas12a反应中，信号产生的速度和效率在降低的温度下显著降低，作者假设存在其他Cas12a同源物在低温下可能优于LbCas12。作者评估了先前报道的6种具有反式核酸酶活性的Cas12a同源物：BsCas12a、BoCas12a、ErCas12a、FnCas12、TsCas12a和AsCas12a。结果显示，TsCas12a在20°C至37°C间都表现出较高的效率（图d）。

为了评估室温RPA-TsCas12a的特异性，作者测试了HPV-16反应与其他HPV类型的交叉反应性。结果只观察到HPV-16的信号（图e， f）。且添加高达3ng的人类基因组DNA不会引起假阳性（图g）。这些发现表明，RPA-TsCas12a具有敏感性和特异性，室温、单管RPA-TsCas12a反应适合作为诊断试剂进一步开发。

作者在实验条件下研究了TsCas12a在低温RPA-Cas反应中表现优异的机制。定量动力学分析表明，在室温诊断应用中，快速核酸酶激活比较高的稳态反式裂解活性更重要。结果显示，在37°C下，TsCas12a被靶标激活的速度比LbCas12a快了近10倍，但稳态反式核酸酶活性大约慢了50%（图f）。当反应在25°C下进行时，反应速率减慢，但TsCas12a的激活速度仍明显快于LbCas12a，稳态反式核酸酶活性略高。

作者对HPV-16阳性和HPV-16阴性宫颈拭子样本进行了分析。样品只经过煮沸10分钟处理，并在25°C下进行RPA-TsCas12a反应。阳性样品中存在的HPV-16 DNA浓度范围很广，其含量低至120拷贝/μL。结果显示，在30分钟内，所有HPV-16阳性样本均出现强烈的荧光信号，与阴性样本明显区分（图a，b），可以100%的灵敏度和100%的特异性区分HPV-16阳性样本和阴性样本（图d）。

结合LFA技术，在25°C下进行反应的8个阳性样品中，有7个样品的测试线强度大于阴性样品的测试线强度，基于选择产生100%特异性的阈值，检测灵敏度为87.5%。但缺陷在于阴性患者样本的测试线上也存在一些背景信号，说明需要进一步优化。这些结果表明，RPA-TsCas12a能够区分阳性和阴性样品，进一步的LFA优化将产生更高的灵敏度。

单管RPA -TsCas12a反应在60分钟内LOD为11 aM，预计Cas12a修饰将提高性能，增加稳态裂解活性，同时保持快速的反式核酸酶激活。研究更多的Cas12a同源物，特别是来自嗜冷生物的Cas12a酶，也可能导至酶具有这样的性质。

温度降低导至信号上升到高灵敏度的时间延迟增加，这主要是由于RPA在较低温度下产生扩增子的效率逐渐降低，而不是TsCas12a的性能。因此，通过在较低温度下提高RPA靶扩增效率，可以实现对提高整体分析性能的最大影响，包括克服延迟信号产生所带来的限制。当前应用的实际解决方案是建议在指定温度或高于指定温度下进行反应，并间隔一段孵育时间后再进行结果读取。这种方法与快速抗原试验的做法类似，尽管信号往往出现得更早，但只有在特定的潜伏期后结果才有效。

在本研究中，作者开发了一种单管室温RPA-CRISPR反应，无需维持较高的反应温度和多步骤样品制备。作者发现TsCas12a在25°C下是一种高活性的核酸酶，并利用该酶开发了一种单步骤RPA-Cas12a检测反应。定量动力学分析表明，在室温诊断应用中，快速核酸酶激活比较高的稳态反式裂解活性更重要。在25°C下进行的RPA-TsCas12a反应可通过光学和侧流读数有效检测粗制宫颈拭子样本中的HPV-16，具有高灵敏度和特异性。本文开发的反应减少了中低收入国家负担得起的诊断的复杂性和设备需求。