• m指宏基因组，也称元基因组，是标本中全部生物（人、微生物）基因组的总称。
• mNGS指对标本中的全部生物基因组进行NGS分析。在感染性疾病诊断领域中，侧重于病原微生物基因组的识别和分析。

mNGS临床应用适应性说明

样本前处理

mNGS技术本质上是一种核酸检测手段，由于采集的样本中通常含有潜在的致病病原体，因此在核酸提取之前，通常需要对样本进行灭活处理。

按照病原类型，病原体检测可划分为病毒、细菌及真菌、寄生虫检测。

由于不同类别的微生物在结构上存在显著差异，其核酸释放效率也各不相同。特别是对于真菌、分枝杆菌等微生物，其核酸提取通常需要特定的细胞壁破坏处理。

除此之外，mNGS检测涵盖了多种样本类型，常见的有静脉血、脑脊液、肺泡灌洗液、痰液、胸水和腹水、咽部分泌物、局部穿刺物以及组织样本等。原则上，来自感染部位的体液或组织样本在敏感性、特异性和可靠性方面表现更佳。若感染部位的体液或分泌物难以采集，或样本质量不理想，则可以选择血液样本作为替代。

其中，痰液样本在灭活处理后还需进行去粘处理，而血液样本则根据具体情况进行判断，以决定是否通过离心操作来分离血浆和白细胞。

mNGS感染标本送检类型及注意事项

不同类型临床标本前处理方法

与NIPT相比，mNGS的样本类型更为多样，且其前处理步骤也更为复杂，这个特点构成了mNGS全流程自动化过程中的主要挑战。

不同标本在前处理方法上有所区别，即便属于同一类型的标本，在进行不同检测项目时也可能需要采取不同的处理手段。例如，对于痰液样本，在进行真菌检测时，可以采用氢氧化钠进行液化处理；然而，在病毒检测项目中，则应使用生理盐水或DDT进行处理，而不宜使用氢氧化钠。

这是因为氢氧化钠会破坏RNA的结构，影响其提取过程。由于真菌检测不涉及RNA的提取，因此可以使用氢氧化钠；但对于病毒检测而言，由于RNA构成大多数病毒的遗传物质，其完整性的保持至关重要，故不能使用氢氧化钠。

在自动化流程的设计中，必须综合考虑上述种种因素，其复杂性与挑战性不言而喻。

核酸提取

样本类型的多样性决定了核酸提取流程的差异性。不同试剂盒可能对不同病原体的提取效能不同，例如有些试剂盒适合提取病毒，但提取真菌的效能差。因此，必须对选取的病原体核酸提取试剂盒进行验证，包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、病毒、寄生虫等核酸提取效能的验证，避免病原体的漏检。

mNGS技术的一个局限性在于，样本中的高背景噪声往往导至检测灵敏度的下降。这种高背景主要来源于人类宿主成分（如组织活检样本）或复杂的微生物菌群（如呼吸道样本、粪便等）。

在某些感染情况下，病原体的载量可能极低（小于10^3拷贝/ml），例如腹泻患者粪便中的志贺菌或由虫媒传播的发热性疾病患者血浆中的寨卡病毒。

面对这些低载量病原体的感染样本，若存在高背景干扰，在固定的测序深度下，可能导至致病病原体的漏检。因此，针对高宿主背景的样本，在提取过程中必须采取措施，如去除宿主细胞或核酸（进行反向富集），或正向富集病原体，以提升检测的准确性。

核酸提取的标准流程如下：

• 细胞裂解与核酸释放：通过应用裂解液破坏细胞结构，从而使得核酸得以释放并游离于裂解体系中；

• 核酸分离与纯化：移除与核酸相结合的多糖、脂质、蛋白质等生物大分子以及其它杂质分子，确保核酸的纯净度；

• 核酸富集与洗脱：利用特定的洗脱液对核酸进行浓缩处理，以实现核酸的高效富集。

核酸提取常用技术：酚-氯仿提取法、离心柱法、磁珠法。

酚氯仿抽提法

传统的DNA提取方法——酚氯仿抽提法，主要依赖于两种不同的有机溶剂的交替使用来去除蛋白质。

在经过苯酚和氯仿的处理后，细胞破碎液或组织匀浆中的成分被分离。在这一过程中，水相主要溶解以DNA为主的核酸，而有机相则富含多糖和脂类物质，蛋白质则沉淀在两相的交界处。

通过离心使液相分层，随后取出含核酸的水相，并经过多次重复的抽提步骤，将含有核酸的水相合并。

利用核酸在醇中不溶的特性，加入乙醇促使核酸沉淀，随后再次离心以分离和洗脱核酸。

最后，将洗涤后的核酸沉淀进行浓缩与干燥，从而获得高纯度的核酸。

酚氯仿抽提法

离心柱法（硅胶膜）

利用特殊的硅基质吸附材料，可以有效且专一性地吸附核酸，而蛋白质则顺畅地通过。

这种硅胶膜表面的硅醇基团在弱酸性条件下，水合后带负电荷。在溶液中存在一定浓度的阳离子时，这些阳离子形成的桥梁能够中和核酸与硅醇基团之间的表面负电荷，进而使核酸紧密地吸附在硅胶膜表面。相反，在低盐浓度的水溶液状态下，由于硅胶膜的硅醇基团与核酸的磷酸基团之间的静电排斥作用，硅胶膜将释放出核酸。

通过在高盐低pH条件下结合核酸，而在低盐高pH条件下洗脱，实现了核酸的分离与纯化。离心柱纯化法也是试剂盒中提取核酸时广泛采用的技术。

MolPure^® Viral DNA/RNA Kit（柱式法）

磁珠法

磁珠法提取核酸是一项运用纳米技术的先进方法，它涉及对超顺磁性纳米颗粒表面进行精细的修饰和改良，从而制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。

这些磁珠在微观层面上能够特异性地识别并与核酸分子高效结合。核酸与磁珠的结合主要依赖于氢键作用、静电作用以及疏水作用。

在异硫氰酸胍和盐酸胍的处理，以及外加磁场的辅助下，能够从样本中有效地分离出核酸，并洗去那些非特异性吸附的杂质，最终获得高度纯净的核酸。

得益于磁珠法的简易操作和出色的自动化兼容性，它目前在众多领域中应用最为广泛。特别是在核酸提取过程中，磁珠法的使用不仅使得操作变得更加便捷，而且显著提升了处理效率，从而巩固了其在自动化流程中的核心地位。

目前，磁珠法自动核酸提取技术已达到高度成熟阶段，未来如有机会，我们将针对不同厂家的设备进行详细探讨并撰写专题文章。在此，不再进行进一步的详细阐述。

文库构建

在遗传学领域，“文库”一词专指通过分子生物学技术创建的一系列基因片段的集合，在本文中，主要指的是用于测序的文库。

文库构建的过程涉及将基因组DNA样本（或cDNA样本）转换成适合测序的文库，以便在测序平台上进行。这一过程包括DNA样本的随机切割成片段，以及为这些DNA片段两端连接上5’和3’的接头。

mNGS与NIPT一样，主要采用全基因测序的策略，因此，建库环节便是构建全基因组文库，质控合格后（参考前文：NIPT全流程自动化解析），便可启动测序流程。

建库流程

DNA建库流程解析

总结

如何实现mNGS全流程自动化？我认为杰毅生物已经提供了明确的解决方案。

星桥智能分子实验室

策略一：采用机器人与前处理设备、全自动核酸提取纯化仪、测序仪等高端检测设备进行智能联动，实现从前处理、核酸提取到文库构建、高通量测序，再到生物信息学分析的全流程自动化操作。

SMAP™NGS 全自动流水线建库系统

策略二：进一步优化自动化流程，通过将多样本前处理系统、核酸提取、建库等关键步骤整合至一台设备中，实现“标本进，文库出”的高效作业模式。在此基础上，实验室工作人员可以选择手动将构建好的文库上机进行测序，或者借助协作机械臂实现自动化的上机操作，再配合病原微生物基因数据分析软件，实现测序全流程自动管理。

有意撰写一篇深入剖析杰毅生物SMAP™ NGS全自动流水线建库系统的文章，在此立下一个flag，大家拭目以待，何时能完成这一目标。

随着技术的持续发展，我们完全有理由坚信，全流程自动化将在精准医疗领域发挥更加重要的作用，并释放出更大的潜力。

参考资料：

[1]高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识 [J] . 中华检验医学杂志, 2020, 43(12) : 1181-1195. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20200903-00704.

[2]宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识 [J] . 中华检验医学杂志, 2021, 44(2) : 107-120. DOI: 10.3760/cma.j.cn114452-20201026-00794.

[3]宏基因组二代测序技术在血液病患者感染病原诊断中的应用中国专家共识（2023年版）[J]. 中华血液学杂志,2023,44(08)：617-623.DOI:10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2023.08.001.

[4]CIC灼识咨询_病原体检测行业蓝皮书.