【纯干货】华大测序仪表面扩增技术原理深度解析

1. 文库环化

首先，使用常规建库试剂盒获得带有接头序列的双链DNA文库（dsDNA）。通过高温加热，dsDNA解旋为单链DNA（ssDNA）。环化引物（紫色引物）与ssDNA两端互补并结合，在连接酶的作用下形成单链环状DNA（ssCirDNA）。此时，文库需要经过手动操作，这不仅增加了上机操作的复杂度，还可能因连接效率问题造成文库损失。只有成功环化的DNA才能进行后续的RCA滚环扩增。

2. 通过RCA扩增形成DNB

在环化文库中，采用具有链置换活性的恒温聚合酶（如phi29 DNA聚合酶）进行滚环扩增（RCA），从而生成几百个拷贝的DNA纳米球（DNB）。phi29 DNA聚合酶具有较强的链置换活性和持续合成能力，使得扩增过程可以在恒温下进行。

DNB制作示意图

然而，由于滚环扩增过程较为缓慢，它可能会占用更多的上机时间，并且扩增速率的不同会导至DNB大小的不一致，进而影响测序的准确性。如果DNB的扩增速度不均，部分DNB可能会过大，导至占据多个位点甚至形成重复序列（Dup），影响测序通量。

胡斯坦面物质优化DNA分子折叠的专利截图

为了解决这一问题，华大智造的研发人员创新性地引入了三聚氰酸（一种具有胡斯坦面结构的物质）作为交联剂。在RCA扩增过程中，这种物质能在DNA碱基之间产生范德华力，使DNA分子折叠成更加稳定的复合体结构，从而提高了DNB的拷贝数，减小了Dup值。通过这一改进，不仅解决了RCA时间过短导至拷贝数不足的问题，还有效提升了测序质量。

此外，由于RCA是线性扩增，即使扩增过程中出现错误，也不会以指数级放大，从而为Q40甚至未来的Q50测序质量奠定了基础。

即便如此，RCA扩增也并非完美。作为恒温扩增的一种，长片段DNA和短片段DNA的扩增，在相同的扩增速度下产生的拷贝数是不同的。这就会使得短片段文库的DNB具有更多的拷贝数，而长片段文库的DNB拷贝数相对较少。会影响到长片段DNB测序反应信号的检测，最终呈现出短文库长度的偏好性。

还有一点是phi29酶本身的稳定性差，外界环境的轻微变化会非常影响扩增性能，因此在说明书上会标注，尽量不要用手触碰管壁。

MGI测序仪使用说明书截图

3. 将DNB加载到测序芯片

在测序芯片上，使用了区分性修饰工艺，以确保DNB能稳定地附着在芯片的修饰位点。首先，在硅芯片表面涂覆一层SiO2，再沉积钛层，并通过光刻技术对钛层进行标记。接下来，使用氨基硅烷作为DNB的结合位点，并通过氨基硅烷的作用使DNB稳定附着。

加载DNB时，采用了特殊的光刻技术和超声波剥离方法，以确保DNB能够均匀加载并完成测序过程。

DNB加载到测序芯片上

具体的表面修饰方法及DNB加载如下：

1. 在硅芯片上长一层SiO2，在SiO2上沉积一层钛titanium，用传统的光刻和干蚀刻技术对该层进行基准标记。
2. CVD 一层hexamethyldisilizane（HMDS） 六甲基二硅氮烷，表面覆盖UV胶
3. 接下来，利用248 nm光刻工具对光刻胶表面进行阵列曝光，并开发光刻胶以产生阵列剃削暴露的HMDS离散区域。
4. 坑里的HMDS用plasma打掉。
5. 氨基硅烷气相沉积在孔中，为DNB提供附着位点。
6. 在阵列基板上重新涂上一层光刻胶并切割成75mm × 25mm的基板，并用超声波从单个基板上剥离所有光刻胶材料。
7. 接下来，将50 μm聚苯乙烯beads和聚氨酯胶的混合物以一系列平行线涂在每个切成方块的基材上，并将盖片压入胶线中，形成六车道重力/毛细管驱动的流动滑块
8. 氨基硅烷特征作为单个DNB的结合位点，而HMDS抑制特征之间的DNB结合
9. 通过移液比载玻片上的结合位点多移2 - 3倍的dnb，将dnb制备物装载到流动载玻片通道中。载玻片在23°C密闭室中孵育2h，并冲洗以中和pH并去除未结合的dnb
   
   

总结

华大智造的DNB技术通过独特的表面扩增和滚环扩增（RCA）方法，极大提高了DNA扩增的效率和测序的准确性。

这项技术的主要优点包括：

• 高纯度：每个DNB几乎仅有一种序列，确保测序信号的准确读取。
• 成本效益：使用单一DNA聚合酶，降低了扩增过程的成本。
• 空间利用率高：DNB尺寸小，约为几百纳米，芯片空间利用效率高，降低了试剂和芯片的成本。
• 高精度：由于RCA是线性扩增，错误不会被放大，测序准确度高。

然而，DNB技术仍有一些优化空间：

• 扩增过程复杂：需要在机外进行手动操作，文库损耗较大。
• 拷贝数差异：不同DNB的拷贝数差异较大，可能导至文库长度的偏好性。
• read2扩增复杂性：需要额外添加试剂，且read2的测序质量相对较低。
• 芯片成本较高：依赖于芯片进行区分性修饰，芯片加工成本较高。